ខ្សែ RNA ពីរខ្សែ (dsRNA) ELISA KIT

កញ្ចប់នេះគឺជាការភ្ជាប់អង់ស៊ីម-តំណភ្ជាប់ Immunosorbent Assay (ELISA) ជាមួយនឹងប្រព័ន្ធ biotin-Streptavidin សម្រាប់ការវាស់វែងជាបរិមាណនៃ dsRNA ដែលមានប្រវែងលើសពី 60 គូមូលដ្ឋាន (bp) ដោយមិនគិតពីលំដាប់។ចាននេះត្រូវបានស្រោបជាមុនជាមួយនឹងអង្គបដិប្រាណប្រឆាំងនឹង dsRNA ។dsRNA ដែលមានវត្តមាននៅក្នុងគំរូត្រូវបានបន្ថែម និងភ្ជាប់ទៅនឹងអង្គបដិប្រាណដែលស្រោបនៅលើអណ្តូង។ហើយបន្ទាប់មកអង្គបដិប្រាណប្រឆាំង dsRNA ដែលធ្វើ biotinylated ត្រូវបានបន្ថែម និងភ្ជាប់ទៅនឹង dsRNA នៅក្នុងគំរូ។បន្ទាប់ពីការលាងសម្អាត HRP-Streptavidin ត្រូវបានបន្ថែមនិងភ្ជាប់ទៅនឹងអង់ទីករ Biotinylated anti-dsRNA ។បន្ទាប់ពី incubation unbound HRP-Streptavidin ត្រូវបានទឹកនាំទៅឆ្ងាយ។បន្ទាប់មក ដំណោះស្រាយស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ត្រូវបានបន្ថែម និងកាតាលីករដោយ HRP ដើម្បីបង្កើតផលិតផលពណ៌ខៀវ ដែលផ្លាស់ប្តូរទៅជាពណ៌លឿង បន្ទាប់ពីបន្ថែមដំណោះស្រាយបញ្ឈប់អាស៊ីត។ដង់ស៊ីតេនៃពណ៌លឿងគឺសមាមាត្រទៅនឹងបរិមាណគោលដៅនៃ dsRNA ដែលចាប់យកនៅក្នុងចាន។ការស្រូបយកត្រូវបានវាស់នៅ 450 nm ។

ការដាក់ពាក្យ

ឧបករណ៍នេះគឺសម្រាប់វាស់បរិមាណនៃ dsRNA សំណល់។

សមាសធាតុនៃកញ្ចប់

ការផ្ទុកនិងស្ថេរភាព

1. សម្រាប់កញ្ចប់ដែលមិនបានប្រើ៖ កញ្ចប់ទាំងមូលអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2~8 ℃ ក្នុងជីវិតធ្នើ។ពន្លឺខ្លាំងគួរតែត្រូវបានជៀសវាងសម្រាប់ស្ថេរភាពនៃការផ្ទុក។

2. សម្រាប់កញ្ចប់ដែលបានប្រើ៖ នៅពេលដែលមីក្រូប្លាតត្រូវបានបើក សូមគ្របអណ្តូងដែលមិនបានប្រើជាមួយនឹងឧបករណ៍ផ្សាភ្ជាប់ចាន ហើយត្រលប់ទៅថង់ foil ដែលមានកញ្ចប់ desiccant, zip-seal the foil pouch and return to 2~8 ℃ ឱ្យបានឆាប់តាមដែលអាចធ្វើបានបន្ទាប់ពីប្រើប្រាស់។សារធាតុ​ប្រតិកម្ម​ផ្សេង​ទៀត​គួរ​ត្រូវ​បាន​ត្រឡប់​ទៅ 2 ~ 8 ℃​ឱ្យ​បាន​ឆាប់​តាម​ដែល​អាច​ធ្វើ​ទៅ​បាន​បន្ទាប់​ពី​ការ​ប្រើ​ប្រាស់​។

សម្ភារៈដែលត្រូវការ ប៉ុន្តែមិនត្រូវបានផ្គត់ផ្គង់

1. ឧបករណ៍អានមីក្រូបន្ទះជាមួយតម្រង 450 ± 10nm (ប្រសើរជាងប្រសិនបើអាចរកឃើញនៅរលកចម្ងាយ 450 និង 650 nm) ។

2. Microplate shaker ។

3. គន្លឹះគ្មាន RNase និងបំពង់ centrifuge ។

គំនូសតាងលំហូរប្រតិបត្តិការ

មុនពេលអ្នកចាប់ផ្តើម

1. នាំយកសមាសធាតុ និងគំរូទាំងអស់ទៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ (18-25 ℃) មុនពេលប្រើប្រាស់។ប្រសិនបើឧបករណ៍នេះនឹងមិនប្រើអស់ក្នុងពេលតែមួយទេ សូមយកតែបន្ទះ និងសារធាតុប្រតិកម្មចេញសម្រាប់ការពិសោធន៍បច្ចុប្បន្ន ហើយទុកបន្ទះ និងសារធាតុប្រតិកម្មដែលនៅសល់ក្នុងលក្ខខណ្ឌដែលត្រូវការ។

2. Wash buffer: ពនឺ 40mL នៃ 20x concentrated wash buffer ជាមួយនឹង 760mL នៃ deionized or distilled water ដើម្បីរៀបចំ 800mL នៃ wash buffer 1× ។

3. ស្ដង់ដារ៖ បង្វិលដោយសង្ខេប ឬផ្ដោតលើដំណោះស្រាយស្តុកមុនពេលប្រើ។ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃស្តង់ដារចំនួនបួនដែលបានផ្តល់គឺ 5ng / μL។សម្រាប់ស្តង់ដារ UTP និង pUTP dsRNA សូម dilute ដំណោះស្រាយភាគហ៊ុនទៅ 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL ជាមួយ STE buffer ដើម្បីគូរខ្សែកោងស្តង់ដារ។សម្រាប់ស្តង់ដារ N1-Me-pUTP dsRNA សូម dilute ដំណោះស្រាយភាគហ៊ុនទៅ 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL ជាមួយ STE buffer ដើម្បីគូរខ្សែកោងស្តង់ដារ។សម្រាប់ស្ដង់ដារ 5-OMe-UTP dsRNA សូម dilute ដំណោះស្រាយភាគហ៊ុនទៅ 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL ជាមួយ STE buffer ដើម្បីគូរខ្សែកោងស្តង់ដារ។យើងណែនាំស្តង់ដារអាចត្រូវបានពនឺតាមតារាងខាងក្រោម៖

4. អង្គបដិប្រាណដែលរកឃើញដោយ Biotinylated និងដំណោះស្រាយដំណើរការ HRP-streptavidin៖ បង្វិលដោយសង្ខេប ឬផ្ដោតលើដំណោះស្រាយស្តុកមុនពេលប្រើ។ពនលាយពួកវាទៅនឹងកំហាប់ការងារជាមួយនឹងសតិបណ្ដោះអាសន្ន។

5. ស្រទាប់ខាងក្រោម TMB៖ លេបថ្នាំតាមកម្រិតដែលត្រូវការនៃដំណោះស្រាយជាមួយនឹងគន្លឹះមាប់មគ ហើយកុំបោះចោលដំណោះស្រាយដែលនៅសេសសល់ទៅក្នុងដបម្តងទៀត។ស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ងាយនឹងពន្លឺ កុំដាក់ស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ទៅពន្លឺក្នុងរយៈពេលយូរ។

ការប្រើប្រាស់ពិធីការ

1. កំណត់ចំនួនច្រូតដែលទាមទារសម្រាប់ការវិភាគ។បញ្ចូលបន្ទះនៅក្នុងស៊ុមសម្រាប់ប្រើប្រាស់។បន្ទះចានដែលនៅសេសសល់ដែលមិនត្រូវបានប្រើប្រាស់ក្នុងការវិភាគនេះ គួរតែត្រូវបានវេចខ្ចប់ឡើងវិញនៅក្នុងថង់ជាមួយនឹងសារធាតុ desiccant ។បិទ​ថង់​ឱ្យ​តឹង​សម្រាប់​ទុក​ក្នុង​ទូរទឹកកក។

2. បន្ថែម 100μL នីមួយៗនៃការរំលាយនៃស្តង់ដារ ទទេ និងសំណាកទៅក្នុងអណ្តូងសមស្រប។គ្របដណ្តប់ជាមួយឧបករណ៍បិទភ្ជាប់ចាន។ដុតនំរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងការញ័រនៅ 500 rpm ។សំណាកគួរតែត្រូវបានពនឺជាមួយសតិបណ្ដោះអាសន្ន STE ទៅនឹងការប្រមូលផ្តុំសមស្របសម្រាប់ការវិភាគត្រឹមត្រូវ។

3. ជំហានលាងសម្អាត៖ យកសូលុយស្យុងមកលាងជាមួយ 250μL wash buffer ទៅកាន់អណ្តូងនីមួយៗ ហើយទុកអោយវាឈររយៈពេល 30 វិនាទី។បោះចោលសតិបណ្ដោះអាសន្នលាងសម្អាតទាំងស្រុងដោយខ្ទាស់ចានដាក់លើក្រដាសដែលស្រូបយក។លាងជម្រះទាំងស្រុង 4 ដង។

4. បន្ថែម 100μL នៃ 100μL នៃ 100μL នៃ 100μL នៃ 100μL នៃ biotinylated ដំណោះស្រាយ ដំណើរការ អង្គបដិបក្ខ ធ្វើការ ទៅក្នុងអណ្តូង គ្នា។គ្របដណ្តប់ជាមួយឧបករណ៍បិទភ្ជាប់ចាន។ដុតនំរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងការញ័រនៅ 500 rpm ។

5. ធ្វើជំហានលាងសម្អាតម្តងទៀត។

6. បន្ថែម 100μL នៃដំណោះស្រាយការងារ HRP-streptavidin ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។គ្របដណ្តប់ជាមួយឧបករណ៍បិទភ្ជាប់ចាន។ដុតនំរយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ជាមួយនឹងការញ័រនៅ 500 រូប្លិត។

7. ធ្វើជំហានលាងម្តងទៀតម្តងទៀត។

8. បន្ថែម 100μL នៃដំណោះស្រាយស្រទាប់ខាងក្រោម TMB ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។គ្របដណ្តប់ជាមួយឧបករណ៍បិទភ្ជាប់ចាន។ដាំឱ្យពុះរយៈពេល ៣០ នាទីនៅ RT ការពារពីពន្លឺ។អង្គធាតុរាវនឹងប្រែទៅជាពណ៌ខៀវដោយការបន្ថែមដំណោះស្រាយស្រទាប់ខាងក្រោម។

9. បន្ថែម 50μL នៃដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ទៅក្នុងអណ្តូងនីមួយៗ។អង្គធាតុរាវនឹងប្រែទៅជាពណ៌លឿងដោយការបន្ថែមដំណោះស្រាយបញ្ឈប់។បន្ទាប់មកដំណើរការ microplate reader ហើយធ្វើការវាស់វែងនៅ 450nm ភ្លាមៗ។

ការគណនាលទ្ធផល

1. ជាមធ្យមការអានស្ទួនសម្រាប់ស្តង់ដារ ការគ្រប់គ្រង និងគំរូនីមួយៗ ហើយដកដង់ស៊ីតេអុបទិកស្តង់ដារជាមធ្យមសូន្យ។បង្កើតខ្សែកោងស្តង់ដារជាមួយនឹងការស្រូបយកនៅលើអ័ក្សបញ្ឈរ (Y) និងការប្រមូលផ្តុំ dsRNA នៅលើអ័ក្សផ្ដេក (X) ។

2. វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យធ្វើការគណនាជាមួយនឹងកម្មវិធីដែលសមស្របតាមខ្សែកោងដែលមានមូលដ្ឋានលើកុំព្យូទ័រ ដូចជាអ្នកជំនាញខ្សែកោង 1.3 ឬ ELISA Calc នៅក្នុងគំរូដែលសមមិនលីនេអ៊ែរ 5 ឬ 4 ប៉ារ៉ាម៉ែត្រ។

ការសម្តែង

1. អារម្មណ៍៖

ដែនកំណត់ទាបនៃការរកឃើញ៖ ≤ 0.001pg/μL (សម្រាប់ UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (សម្រាប់ 5-OME-UTP-dsRNA) ។

ដែនកំណត់ទាបនៃបរិមាណ៖ 0.0156 pg/μL (សម្រាប់ UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (សម្រាប់ N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (សម្រាប់ 5-OMe-UTP-dsRNA) ។

2. ភាពជាក់លាក់៖ CV of Intra-Assay ≤10%, CV of Inter-Assay ≤10%

3. ការងើបឡើងវិញ: 80% ~ 120%

4.Linearity: 0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(សម្រាប់ 5-Ome-UTP-dsRNA)។

ការពិចារណា

1. សីតុណ្ហភាព និងពេលវេលាប្រតិកម្មរបស់ TMB គឺសំខាន់ណាស់ សូមគ្រប់គ្រងពួកវាតាមការណែនាំយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។

2. ដើម្បីសម្រេចបាននូវភាពអាចផលិតឡើងវិញបាន និងភាពរសើបនៃការវិភាគល្អ ការលាងចានឱ្យបានត្រឹមត្រូវដើម្បីយកសារធាតុដែលមិនមានប្រតិកម្មលើសគឺចាំបាច់ណាស់។

3. រាល់ reagents គួរតែត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់មុនពេលប្រើប្រាស់ និងជៀសវាងការ bumbles កំឡុងពេលសំណាកគំរូ ឬ reagents បន្ថែម។

4. ប្រសិនបើគ្រីស្តាល់បានបង្កើតឡើងនៅក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្នលាងសម្អាតដែលប្រមូលផ្តុំ (20x) កំដៅដល់ 37 ℃ ហើយលាយថ្នមៗរហូតដល់គ្រីស្តាល់ត្រូវបានរំលាយទាំងស្រុង។

5. ជៀសវាងការវិភាគសំណាកដែលមានសារធាតុ Sodium Azide (NaN3) ព្រោះវាអាចបំផ្លាញសកម្មភាព HRP ដែលបណ្តាលឱ្យមានការប៉ាន់ប្រមាណតិចតួចនៃបរិមាណ dsRNA ។

6. ជៀសវាងការចម្លងរោគ RNase កំឡុងពេលធ្វើតេស្ត។

7. ស្តង់ដារ/គំរូ អង្គបដិបក្ខរាវរក និង SA-HRP ក៏អាចត្រូវបានធ្វើឡើងនៅ RT ដោយមិនញ័រ ប៉ុន្តែវាអាចបណ្តាលឱ្យមានការថយចុះនូវភាពប្រែប្រួលនៃការរកឃើញមួយដង។ចំពោះករណីនេះ យើងសូមណែនាំស្តង់ដារ UTP និង pUTP dsRNA គួរតែត្រូវបានពនឺពី 2pg/μL ស្តង់ដារ N1-Me-pUTP dsRNA គួរតែត្រូវបានពនឺពី 4pg/μL និងស្តង់ដារ 5-OME-UTP dsRNA គួរតែត្រូវបានពនឺពី 8pg/μL ។លើសពីនេះទៀត incubate ដំណោះស្រាយការងារ HRP-streptavidin សម្រាប់ 60 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។កុំប្រើទឹកក្រឡុកដប ព្រោះទឹកក្រឡុកអាចផ្តល់លទ្ធផលមិនត្រឹមត្រូវ។

លទ្ធផលធម្មតា។

1. ទិន្នន័យខ្សែកោងស្តង់ដារ

2. ការគណនាខ្សែកោងស្តង់ដារ

3. ជួររកឃើញស្រទាប់៖ 0.0312- 1pg/μL