mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase ត្រូវបានចេញមកពីប្រភេទ E. coli ផ្សំឡើងវិញ ដែលផ្ទុកហ្សែនសម្រាប់វ៉ាក់សាំង mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase ។អង់ស៊ីមនេះបន្ថែមក្រុមមេទីលនៅទីតាំង 2´-O នៃនុយក្លេអូទីតទីមួយដែលនៅជាប់នឹងរចនាសម្ព័ន្ធមួកនៅចុង 5´ នៃ RNA។ អង់ស៊ីមប្រើប្រាស់ S-adenosylmethionine (SAM) ជាអ្នកផ្តល់មេទីលដល់មេទីលដែលបិទបាំង RNA (cap -0) ជាលទ្ធផលនៅក្នុងរចនាសម្ព័ន្ធ cap- 1 ។

រចនាសម្ព័ន Cap1 អាចបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការបកប្រែ ធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវការបញ្ចេញមតិរបស់ mRNA ក្នុងការឆ្លង និងការពិសោធន៍ដោយ microinjection។ អង់ស៊ីមនេះជាពិសេសត្រូវការ RNA ជាមួយនឹងមួក m7GpppN ជាស្រទាប់ខាងក្រោម។វាមិនអាចប្រើប្រាស់ RNA ជាមួយ pN, ppN, pppN ឬ GpppN នៅចុងបញ្ចប់ 5' បានទេ។Capped RNA អាចត្រូវបានរៀបចំតាមរយៈការចម្លងនៅក្នុង vitro ដោយប្រើ cap analog ឬតាមរយៈ enzymatic capping ដោយប្រើ Vaccinia Capping Enzyme។

សមាសធាតុ

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × Capping សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម

ការផ្ទុក

-25 ～- 15 ℃ សម្រាប់ការផ្ទុក (ជៀសវាងការបង្កកម្តងហើយម្តងទៀត)

សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្ទុក

20 mM Tris-HCl (pH 8.0,25 ℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol ។

និយមន័យឯកតា

ឯកតាមួយត្រូវបានកំណត់ថាជាបរិមាណអង់ស៊ីមដែលត្រូវការសម្រាប់មេទីល 10 pmoles នៃ 80 nt capped RNA transcript ក្នុងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេ។

ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព

Exonuclease: 50U នៃ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ជាមួយ 1μg λ-Hind III រំលាយ DNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់ទិន្នផលគ្មានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។

អង់ដូណូក្លូស: 50 U នៃ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ជាមួយ 1 μg λDNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។

នីកាស: 50U នៃ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ជាមួយ 1μg pBR322 នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់ផលមិនរិចរិលដូចដែលកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។

RNase: 50U នៃ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ជាមួយ 1.6μg MS2 RNA រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។

E. កូលី ឌីអិនអេ៖ 50U នៃ mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase ត្រូវបានពិនិត្យរកមើលវត្តមានរបស់E. កូលី DNA ហ្សែនដោយប្រើ TaqMan qPCR ជាមួយ primers ជាក់លាក់សម្រាប់E. កូលី ទីតាំង 16S rRNA ។នេះ។E. កូលី ការចម្លងរោគ DNA ហ្សែនគឺ = 1E. កូលី ហ្សែន។

បាក់តេរី អង់ដូតូស៊ីន: LAL-test នេះ​បើ​យោង​តាម​ការ​បោះពុម្ព​របស់​ឱសថស្ថាន​ចិន IV 2020 វិធីសាស្ត្រ​ធ្វើតេស្ត​កម្រិត​ជែល ច្បាប់​ទូទៅ (1143)។មាតិកាអង់ដូតូស៊ីនរបស់បាក់តេរីគួរតែមាន = 10 EU/mg ។

ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មនិងលក្ខខណ្ឌ

1. រួមបញ្ចូលគ្នានូវបរិមាណសមស្របនៃ Capped RNA និង H2O ដែលគ្មាន RNase នៅក្នុងបំពង់មីក្រូហ្វាយ 1.5 mL ទៅនឹងបរិមាណចុងក្រោយនៃ 16.0 µL ។

2. កំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65 ℃ 5 នាទី បន្តដោយទឹកកក 5 នាទី។

3. បន្ថែមសមាសធាតុដូចខាងក្រោមក្នុងលំដាប់ដែលបានបញ្ជាក់ (សម្រាប់មេទីលនៃ Capped RNA

តិចជាង 10

* 10 × Capping Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT ។

4. Incubate នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 1 ម៉ោង (2 ម៉ោងនៃការ incubation ត្រូវបានណែនាំសម្រាប់បំណែកគោលដៅតិចជាង 200 nt) ។

កម្មវិធី

ដើម្បីកែលម្អការបញ្ចេញមតិ mRNA កំឡុងពេលពិសោធន៍ microinjection និង transfection ។

កំណត់ចំណាំក្នុងការប្រើប្រាស់

1. មុនពេលប្រតិកម្ម RNA គួរតែត្រូវបានបន្សុត និងរំលាយនៅក្នុងទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ ដំណោះស្រាយទាំងអស់មិនគួរមាន EDTA និងអ៊ីយ៉ុងណាមួយឡើយ។

2. វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យកំដៅ RNA គំរូនៅ 65 ℃សម្រាប់ 5 នាទីមុនពេលមានប្រតិកម្មដើម្បីយកចេញរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៅលើ 5'ចុងនៃប្រតិចារិក។វាអាចត្រូវបានពង្រីកដល់ 10 នាទីសម្រាប់រចនាសម្ព័ន្ធស្ថានីយស្មុគស្មាញ 5 ´។