អង់ស៊ីម Capping Virus Vaccinia
អង់ស៊ីមការពារមេរោគ Vaccinia គឺបានមកពីប្រភេទ E. coli ដែលផ្សំឡើងពីហ្សែនសម្រាប់អង់ស៊ីម Vaccinia capping ។អង់ស៊ីមតែមួយនេះត្រូវបានផ្សំឡើងដោយអនុរងពីរ (D1 និង D12) និងមានសកម្មភាពអង់ស៊ីមបី (RNA triphosphatase និង guanylyltransferase ដោយអនុក្រុម D1 និង guanine methyltransferase ដោយអនុរង D12) ។អង់ស៊ីម Capping Virus Vaccinia មានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការជំរុញការបង្កើតរចនាសម្ព័ន្ធមួក ដែលអាចភ្ជាប់រចនាសម្ព័ន្ធមួក 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) ទៅចុង 5′ នៃ RNA ។រចនាសម្ព័ន្ធ Cap (Cap 0) ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់ក្នុងស្ថេរភាព mRNA ការដឹកជញ្ជូន និងការបកប្រែនៅក្នុង eukaryotes ។ការបិទភ្ជាប់ RNA ដោយប្រតិកម្មអង់ស៊ីម គឺជាវិធីសាស្ត្រដ៏មានប្រសិទ្ធភាព និងសាមញ្ញ ដែលអាចធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវស្ថេរភាព និងការបកប្រែ RNA យ៉ាងសំខាន់សម្រាប់ការចម្លងក្នុង vitro transfection និង microinjection ។
សមាសធាតុ
Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)
10 × Capping Buffer
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
-25～-15℃ សម្រាប់ការផ្ទុក (ជៀសវាងការបង្កកម្តងហើយម្តងទៀត)
សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្ទុក
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol ។
និយមន័យឯកតា
មួយឯកតានៃមេរោគ Vaccinia Capping Enzyme ត្រូវបានកំណត់ថាជាបរិមាណអង់ស៊ីមដែលត្រូវការដើម្បីបញ្ចូល 10pmol នៃ GTP ទៅក្នុងប្រតិចារឹក 80nt ក្នុងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
Exonuclease៖10U នៃ Vaccinia virus Capping Enzyme ជាមួយនឹង 1μg λ-Hind III រំលាយ DNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
Endonuclease៖10U នៃ Vaccinia virus Capping Enzyme ជាមួយនឹង 1μg λDNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
នីកាស៖10U នៃ Vaccinia virus Capping Enzyme ជាមួយនឹង 1 μg pBR322 នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
RNase៖10U នៃ Vaccinia virus Capping Enzyme ជាមួយ 1.6μg MS2 RNA សម្រាប់រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ ផ្តល់ទិន្នផលគ្មានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
1.coli DNA:10U នៃមេរោគ Vaccinia Capping Enzyme ត្រូវបានពិនិត្យរកមើលវត្តមានរបស់ E. coli genomic DNA ដោយប្រើ TaqMan qPCR ជាមួយនឹង primers ជាក់លាក់សម្រាប់ទីតាំង E. coli 16S rRNA ។ការចម្លងរោគ DNA ហ្សែន E. coli គឺ≤1 E. coli genome ។
2.បាក់តេរី អង់ដូតូស៊ីន៖ LAL-test នេះបើយោងតាមការបោះពុម្ពរបស់ឱសថស្ថានចិន IV 2020 វិធីសាស្ត្រធ្វើតេស្តកម្រិតជែល ច្បាប់ទូទៅ (1143)។មាតិកាអង់ដូតូស៊ីនរបស់បាក់តេរីគួរតែមាន ≤10 EU/mg។
ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មនិងលក្ខខណ្ឌ
1. Capping Protocol (បរិមាណប្រតិកម្ម៖ 20 μL)
នីតិវិធីនេះអាចអនុវត្តបានចំពោះប្រតិកម្ម capping នៃ 10μg RNA (≥100 nt) ហើយវាអាចត្រូវបានធ្វើមាត្រដ្ឋានតាមតម្រូវការពិសោធន៍។
I) ផ្សំ RNA 10μg និង H2O ដែលគ្មាននុយក្លេអែរក្នុងបំពង់មីក្រូហ្វូស 1.5 មីលីលីត្រ ទៅនឹងបរិមាណចុងក្រោយនៃ 15.0 µL ។*10 × Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8.0)
2) កំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65 ℃ 5 នាទី បន្តដោយទឹកកក 5 នាទី។
3) បន្ថែមសមាសភាគខាងក្រោមនៅក្នុងលំដាប់ដែលបានបញ្ជាក់
| Cវត្ថុធាតុ | Vអូលូម |
| Denatured RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 μL |
| 10 × Capping Buffer * | 2 μL |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| អង់ស៊ីម Capping Virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
* 10 × Capping Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) បង្កាត់នៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេរយៈពេល 30 នាទី ឥឡូវនេះ RNA ត្រូវបានបិទហើយរួចរាល់សម្រាប់កម្មវិធីខាងក្រោម។
2. 5′ ស្ថានីយ ប្រតិកម្មស្លាក (បរិមាណប្រតិកម្ម៖ 20 μL)
ពិធីការនេះត្រូវបានរចនាឡើងដើម្បីដាក់ស្លាក RNA ដែលមាន 5' triphosphate ហើយវាអាចត្រូវបានពង្រីកតាមតម្រូវការ។ប្រសិទ្ធភាពនៃការរួមបញ្ចូលស្លាកនឹងត្រូវបានប៉ះពាល់ដោយសមាមាត្រ molar នៃ RNA: GTP ក៏ដូចជាមាតិកា GTP នៅក្នុងគំរូ RNA ។
1) បញ្ចូលគ្នានូវបរិមាណសមស្របនៃ RNA និង H2O ដែលគ្មាននុយក្លេអែរនៅក្នុងបំពង់មីក្រូហ្វូស 1.5 មីលីលីត្រ ទៅនឹងបរិមាណចុងក្រោយនៃ 14.0 µL ។
2) កំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65 ℃ 5 នាទី បន្តដោយទឹកកក 5 នាទី។
3) បន្ថែមសមាសភាគខាងក្រោមនៅក្នុងលំដាប់ដែលបានបញ្ជាក់។
| Cវត្ថុធាតុ | Vអូលូម |
| RNA ធម្មជាតិ | 14 μL |
| 10 × Capping Buffer | 2 μL |
| ល្បាយ GTP ** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| អង់ស៊ីម Capping Virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX សំដៅលើ GTP និងសញ្ញាសម្គាល់មួយចំនួនតូច។សម្រាប់ការផ្តោតអារម្មណ៍របស់ GTP សូមយោងដល់ចំណាំ 3 ។
4) ដុតនំនៅសីតុណ្ហភាព 37 អង្សារសេរយៈពេល 30 នាទី RNA 5′ ចុងបញ្ចប់ត្រូវបានដាក់ស្លាកហើយរួចរាល់សម្រាប់ទឹកខាងក្រោម។
កម្មវិធី
1. ការបិទ mRNA មុនពេលការបកប្រែ ការវិភាគ/ការបកប្រែក្នុង vitro
2. ការដាក់ស្លាកសញ្ញា 5´ ចុងបញ្ចប់នៃ mRNA
កំណត់ចំណាំក្នុងការប្រើប្រាស់
1.កំដៅដំណោះស្រាយនៃ RNA មុនពេល incubation ជាមួយ Vaccinia Capping Enzyme យករចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំនៅលើ 5'end នៃប្រតិចារិក។ពង្រីកពេលវេលាដល់ 60 នាទីសម្រាប់ប្រតិចារិកដែលមាន 5'ends ដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធខ្ពស់ដែលគេស្គាល់។
2. RNA ដែលប្រើសម្រាប់ប្រតិកម្ម capping គួរតែត្រូវបានបន្សុតមុនពេលប្រើប្រាស់ និងផ្អាកក្នុងទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។EDTA មិនគួរមានវត្តមានទេ ហើយដំណោះស្រាយគួរតែគ្មានអំបិល។
3. សម្រាប់ការដាក់ស្លាកសញ្ញាចុង 5' ការប្រមូលផ្តុំ GTP សរុបគួរតែមានប្រហែល 1-3 ដងនៃកំហាប់ molar នៃ mRNA នៅក្នុងប្រតិកម្ម។
4. បរិមាណនៃប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអាចត្រូវបានធ្វើមាត្រដ្ឋានឡើងឬចុះដោយយោងទៅតាមការពិត។
