កញ្ចប់ EndoFree Plasmid Maxi

លក្ខខណ្ឌផ្ទុក

RNaseA គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -30 ~ -15 ℃ និងដឹកជញ្ជូននៅ ≤0 ℃ ។

Endotoxin Scavenger អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2 ~ 8 ℃សម្រាប់មួយខែ រក្សាទុកនៅ -30 ~ -15 ℃សម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែងនិងដឹកជញ្ជូននៅ ≤0 ℃ ។

សមាសធាតុផ្សេងទៀតគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (15 ~ 25 ℃) និងដឹកជញ្ជូននៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

សមាសធាតុ

RNaseA៖10 mg/ml ប្រើដើម្បីលុប RNA ។

Buffer P1:សតិបណ្ដោះអាសន្នការព្យួរបាក់តេរី បន្ថែម RNaseA ទៅ Buffer P1 មុនពេលប្រើលើកដំបូង។

Buffer P2៖សតិបណ្ដោះអាសន្នលីហ្សីបាក់តេរី (មានផ្ទុក SDS/NaOH)។

Buffer P4៖neutralizing buffer ។

អ្នករើសអេតចាយ Endotoxin៖មានប្រសិទ្ធភាពយក endotoxin ចេញពីចំរាញ់ចេញពី plasmid ឆៅ។

Buffer PW៖លាងសម្អាតសតិបណ្ដោះអាសន្ន បន្ថែមបរិមាណអេតាណុលដែលបានកំណត់មុនពេលប្រើលើកដំបូង។

Buffer TB៖បណ្ដោះអាសន្ន elution ។

ជួរឈរ FastPure DNA Maxi៖ជួរឈរស្រូបយក DNA plasmid ។

បំពង់ប្រមូល 50 មីលីលីត្រ:បំពង់ប្រមូលតម្រង។

បំពង់ប្រមូលគ្មានថ្នាំ Endotoxin៖បំពង់ប្រមូល DNA plasmid ។

សម្ភារៈរៀបចំ

អេតាណុលដាច់ខាត អ៊ីសូប្រូប៉ាណុល 50 មីលីលីត្រ បំពង់ centrifuge បាតមូល និង 50 មីលីលីត្រគ្មាន endotoxinបំពង់ centrifuge ។

កម្មវិធី

ផលិតផលនេះគឺសមរម្យសម្រាប់ការទាញយកទ្រង់ទ្រាយធំនៃ plasmids ពី 150 - 300 មីលីលីត្រនៃដំណោះស្រាយបាក់តេរីវប្បធម៌ពេញមួយយប់។

ដំណើរការពិសោធន៍

1. យក 150 - 200 មីលីលីត្រ (មិនលើសពី 300 មីលីលីត្រ) នៃដំណោះស្រាយបាក់តេរី បណ្តុះពេញមួយយប់ ហើយដាក់ centrifuge នៅប្រហែល 11,000 rpm (12,000 × g) សម្រាប់ 1 - 2 នាទី។បោះបង់ចោល supernatant និងប្រមូលបាក់តេរី។

Δ នៅពេលប្រមូលបានច្រើនជាង 50ml នៃដំណោះស្រាយបាក់តេរី បាក់តេរីអាចប្រមូលបានដោយបន្ថែមដំណោះស្រាយបាក់តេរី ការដាក់ centrifugation ចោល supernatant និងជំហានផ្សេងទៀតនៅក្នុងបំពង់ 50ml ដូចគ្នាសម្រាប់

ច្រើន​ដង។

2. បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រនៃ Buffer P1 (សូមពិនិត្យមើលថាតើ RNaseA ត្រូវបានបន្ថែមទៅ Buffer P1) ទៅ centrifugeបំពង់ដែលមានបាក់តេរី និងលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ដោយ vortex ឬ pipetting ។

Δ ការបញ្ឈប់បាក់តេរីឡើងវិញទាំងស្រុងក្នុងជំហាននេះគឺមានសារៈសំខាន់ក្នុងការផ្តល់ទិន្នផល ហើយមិនគួរមានបណ្តុំបាក់តេរីបន្ទាប់ពីការផ្អាកឡើងវិញនោះទេ។ប្រសិនបើមានចង្កោមបាក់តេរីដែលមិនត្រូវបានលាយបញ្ចូលគ្នាឱ្យបានហ្មត់ចត់នោះ វានឹងប៉ះពាល់ដល់សារធាតុលីស ដែលបណ្តាលឱ្យមានទិន្នផលទាប និងភាពបរិសុទ្ធ។ប្រសិនបើ OD600 នៃដំណោះស្រាយបាក់តេរីគឺ 0.65 វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើ 7.5 មីលីលីត្រនៃ Buffer P1 នៅពេលស្រង់ចេញពី 150 មីលីលីត្រនៃដំណោះស្រាយបាក់តេរី។នៅពេលដែល OD600 គឺ 0.75, 8 មីលីលីត្រនៃ Buffer P1 គួរតែត្រូវបានប្រើ ហើយបរិមាណនៃ Buffers P2 និង P4 គួរតែត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរទៅតាមនោះ។ប្រសិនបើបរិមាណនៃដំណោះស្រាយបាក់តេរីត្រូវបានកើនឡើងដល់ 200 មីលីលីត្រ វាត្រូវបានណែនាំអោយប្រើបរិមាណ Buffers P1, P2, និង P4 ត្រូវបានកើនឡើងតាមសមាមាត្រ។

3. បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រនៃ Buffer P2 ទៅការព្យួរបាក់តេរីពីជំហានទី 2 ហើយលាយថ្នមៗឡើងលើចុះក្រោមរយៈពេល 6 - 8ដងនិង incubate នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ 4-5 នាទី។

Δ ដាក់បញ្ច្រាសថ្នមៗដើម្បីលាយយ៉ាងហ្មត់ចត់។Vortexing នឹងបណ្តាលឱ្យមានការបែងចែក DNA ហ្សែនដែលបណ្តាលឱ្យមានបំណែក DNA ហ្សែននៅក្នុង plasmid ដែលបានស្រង់ចេញ។នៅពេលនេះ ដំណោះស្រាយក្លាយជា viscous និង translucent ដែលបង្ហាញថាបាក់តេរីត្រូវបាន lysed ពេញលេញ។រយៈពេលមិនគួរលើសពី 5 នាទីដើម្បីជៀសវាងការបំផ្លាញ plasmids ។ប្រសិនបើដំណោះស្រាយមិនច្បាស់លាស់ វាអាចមានបាក់តេរីច្រើនពេកលីសមិនពេញលេញ ដូច្នេះបរិមាណបាក់តេរីគួរត្រូវបានកាត់បន្ថយឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។

4. បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រនៃ Buffer P4 ទៅនឹងការព្យួរបាក់តេរីពីជំហានទី 3 ហើយដាក់បញ្ច្រាសភ្លាមៗ 6 ទៅ 8 ដងដើម្បីឱ្យដំណោះស្រាយធ្វើឱ្យ Buffer P2 បន្សាបទាំងស្រុង។នៅពេលនេះទឹកភ្លៀងពណ៌ស flocculent គួរតែលេចឡើង។Centrifuge នៅច្រើនជាងប្រហែល 11,000 rpm (12,000 × g) រយៈពេល 10 ទៅ 15 នាទី ដោយប្រុងប្រយ័ត្ន បញ្ចូន supernatant ចូលទៅក្នុងបំពង់ centrifuge មូល 50ml ថ្មី (រៀបចំដោយខ្លួនឯង) ហើយជៀសវាងស្រូបយកទឹកភ្លៀងពណ៌សអណ្តែត។

Δ បន្ថែម Buffer P4 ហើយដាក់បញ្ច្រាសភ្លាមៗដើម្បីលាយល្អ។ទុកបំពង់ឱ្យឈររហូតទាល់តែទឹកភ្លៀងពណ៌សត្រូវបានចែកចាយស្មើៗគ្នានៅទូទាំងដំណោះស្រាយដើម្បីការពារការផលិតទឹកភ្លៀងក្នុងតំបន់ដែលអាចប៉ះពាល់ដល់ការបន្សាបជាតិពុល។ប្រសិនបើមិនមានទឹកភ្លៀង flocculent ពណ៌សឯកសណ្ឋានមុនពេល centrifugation ហើយ supernatant គឺមិនច្បាស់បន្ទាប់ពីការ centrifugation បំពង់អាចជាcentrifuged រយៈពេល 5 នាទីទៀត។

5. បន្ថែម 0. 1 ដងនៃបរិមាណ (10% នៃបរិមាណ supernatant ប្រហែល 2.2 មីលីលីត្រ) នៃ Endotoxin Scavenger ទៅ supernatant ពីជំហានទី 4 ហើយដាក់បញ្ច្រាសទៅលាយ។ដាក់​សូលុយស្យុង​ក្នុង​អាង​ទឹកកក ឬ​បញ្ចូល​ទៅក្នុង​ទឹកកក​កំទេច (ឬ​ទូរ​ទឹកកក​) រយៈពេល 5 នាទី រហូតទាល់តែ​ដំណោះស្រាយ​ផ្លាស់ប្តូរ​ពី​ប្រែពណ៌​ទៅជា​ថ្លា និង​ថ្លា (ឬ​នៅតែរមួលបន្តិច) ហើយម្តងម្កាលលាយច្រើនដង។

Δ បន្ទាប់ពី Endotoxin Scavenger ត្រូវបានបន្ថែមទៅ supernatant នោះ supernatant នឹងក្លាយទៅជាមានភាពច្របូកច្របល់ ប៉ុន្តែsupernatant គួរតែច្បាស់ (ឬមានភាពច្របូកច្របល់បន្តិច) បន្ទាប់ពីត្រជាក់នៅក្នុងអាងងូតទឹក។

6. បន្ទាប់ពី​ដាក់​នៅ​សីតុណ្ហភាព​បន្ទប់ (> 25 ℃​) រយៈពេល 10 – 15 នាទី វា​នឹង​ប្រែជា​ច្របូកច្របល់​។សីតុណ្ហភាពរបស់វាកើនឡើងដល់សីតុណ្ហភាពបន្ទប់។បន្ទាប់មក supernatant គួរតែត្រូវបានដាក់បញ្ច្រាសដើម្បីលាយ។

Δ ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ទាបជាង ឬអ្នកចង់កាត់បន្ថយពេលវេលានៃការស្រង់ចេញ ពពួក supernatant អាចត្រូវបាន incubated ក្នុងទឹក 37 ~ 42 ℃ រយៈពេល 5 – 10 នាទី ហើយជំហានបន្ទាប់អាចត្រូវបានអនុវត្តបន្ទាប់ពី supernatantក្លាយជាច្របូកច្របល់។

7. រំកិលមជ្ឈិមបូព៌ានៅប្រហែល 11,000 rpm (12,000 × g) រយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ (សីតុណ្ហភាពត្រូវតែ> 25 ℃) ដើម្បីបំបែកដំណាក់កាល។ដំណាក់កាលទឹកខាងលើមានផ្ទុក DNA ខណៈពេលដែលស្រទាប់នៃដំណាក់កាលប្រេងពណ៌ខៀវខាងក្រោមមានផ្ទុកសារធាតុ endotoxin និងសារធាតុមិនបរិសុទ្ធផ្សេងទៀត។ផ្ទេរដំណាក់កាល aqueous ដែលមាន DNA ទៅបំពង់ថ្មី និងបោះបង់ចោលស្រទាប់ខ្លាញ់។

Δ សីតុណ្ហភាពកំឡុងពេល centrifugation ត្រូវតែលើសពី 25 ℃ ដោយសារការបំបែកដំណាក់កាលមានប្រសិទ្ធភាពមិនមានកើតឡើងប្រសិនបើសីតុណ្ហភាពទាបពេក។

Δ ប្រសិនបើការបំបែកដំណាក់កាលមិនមានប្រសិទ្ធភាព សីតុណ្ហភាព centrifugation អាចត្រូវបានលៃតម្រូវទៅ 30 ℃ និងពេលវេលានៃការ centrifugation អាចត្រូវបានកើនឡើងដល់ 15 នាទី។

Δ កុំបឺតស្រទាប់ខ្លាញ់ពណ៌ខៀវព្រោះវាផ្ទុកសារធាតុ endotoxin និងសារធាតុមិនបរិសុទ្ធផ្សេងទៀត។

យន្តការ

ការផ្អាក Lysis អព្យាក្រឹតភាព

◇ បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រ Buffer P1

◇ បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រ Buffer P2

◇ បន្ថែម 7.5 មីលីលីត្រ Buffer P4

ការដកជាតិពុល Endotoxin

◇ បន្ថែម 0. 1 ដងនៃបរិមាណដ៏លើសលុបនៃ Endotoxin Scavenger

ការចងនិងការបោកគក់

◇ បន្ថែម 0.5 ដងនៃបរិមាណ isopropanol

◇ បន្ថែម Buffer PW 10 មីលីលីត្រ