M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase គឺជា transcriptase បញ្ច្រាសដែលទទួលបានដោយការត្រួតពិនិត្យការផ្លាស់ប្តូរនៃហ្សែន M-MLV នៃប្រភពដើមនៃមេរោគមហារីកឈាម Moloney murine និងការបញ្ចេញមតិនៅក្នុង E.coli ។អង់ស៊ីមដកសកម្មភាព RNase H មានភាពធន់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ និងសមរម្យសម្រាប់ការចម្លងបញ្ច្រាសសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។ដូច្នេះវាមានប្រយោជន៍សម្រាប់ការលុបបំបាត់ផលប៉ះពាល់មិនអំណោយផលនៃរចនាសម្ព័ន្ធកម្រិតខ្ពស់ RNA និងកត្តាមិនជាក់លាក់លើការសំយោគ cDNA ហើយមានស្ថេរភាពខ្ពស់ និងសមត្ថភាពសំយោគចម្លងបញ្ច្រាស។អង់ស៊ីមមានស្ថេរភាពខ្ពស់ និងសមត្ថភាពសំយោគចម្លងបញ្ច្រាស។
សមាសធាតុ
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (ជាជម្រើស)
* 5 × First-Strand Buffer មិនមាន dNTP ទេ សូមបន្ថែម dNTPs នៅពេលរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម
កម្មវិធីដែលបានណែនាំ
1.qRT-PCR មួយជំហាន។
2.ការរកឃើញមេរោគ RNA ។
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
-20°C សម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែង គួរលាយបញ្ចូលគ្នាឱ្យបានល្អមុនពេលប្រើប្រាស់ ជៀសវាងការកកញឹកញាប់។
និយមន័យឯកតា
ឯកតាមួយរួមបញ្ចូល 1 nmol នៃ dTTP ក្នុងរយៈពេល 10 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 37°C ដោយប្រើ poly(A)•oligo(dT)25ជាគំរូ / primer ។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
1.SDS-PAGE ភាពបរិសុទ្ធ electrophoretic ធំជាង 98% ។
2.ភាពរសើបនៃការពង្រីក, ការគ្រប់គ្រងជាបាច់ទៅបាច់, ស្ថេរភាព។
3.គ្មានសកម្មភាពនុយក្លេអ៊ែរ exogenous គ្មានការចម្លងរោគ endonuclease ឬ exonuclease
ការរៀបចំប្រតិកម្មសម្រាប់ដំណោះស្រាយប្រតិកម្មសង្វាក់ទីមួយ
1.ការរៀបចំល្បាយប្រតិកម្ម
| សមាសធាតុ | កម្រិតសំឡេង |
| Oligo(dT)១២-18 ថ្នាំ primer ឬថ្នាំ primer ចៃដន្យក ឬហ្សែនជាក់លាក់ primersb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| គំរូ RNA | សរុប RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| ឌីអេច ដោយគ្មាន RNase2O | ទៅ 10 μL |
កំណត់ចំណាំ៖a/b: សូមជ្រើសរើសប្រភេទថ្នាំ primers ផ្សេងៗគ្នាតាមតម្រូវការពិសោធន៍របស់អ្នក។
2.កំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 65 អង្សាសេរយៈពេល 5 នាទីហើយត្រជាក់យ៉ាងលឿនលើទឹកកករយៈពេល 2 នាទី។
3.បន្ថែមសមាសធាតុខាងក្រោមទៅក្នុងប្រព័ន្ធខាងលើក្នុងបរិមាណសរុប 20µL ហើយលាយថ្នមៗ៖
| សមាសធាតុ | បរិមាណ (μL) |
| 5 × First-Stand Buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| ថ្នាំទប់ស្កាត់ RNase (40 U/μL) | 1 |
| ឌីអេច ដោយគ្មាន RNase2O | ទៅ 20 μL |
4. សូមអនុវត្តប្រតិកម្មដោយយោងតាមលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោមៈ
(1) ប្រសិនបើប្រើ Primer ចៃដន្យ ប្រតិកម្មគួរតែត្រូវបានអនុវត្តនៅ 25 ℃ សម្រាប់ 10 នាទី ហើយបន្ទាប់មកនៅ 50 ℃ សម្រាប់ 30 ~ 60 នាទី;
(2) ប្រសិនបើ Oligo dT ឬ primers ជាក់លាក់ត្រូវបានប្រើ ប្រតិកម្មគួរតែត្រូវបានអនុវត្តនៅ 50 ℃ សម្រាប់ 30 ~ 60 នាទី។
5.កំដៅនៅ 95 ℃រយៈពេល 5 នាទីដើម្បីធ្វើឱ្យអសកម្ម Neoscript Reverse Transcriptase និងបញ្ចប់ប្រតិកម្ម។
6.ផលិតផលចម្លងបញ្ច្រាសអាចត្រូវបានប្រើដោយផ្ទាល់នៅក្នុងប្រតិកម្ម PCR និងប្រតិកម្ម PCR បរិមាណ fluorescence ឬរក្សាទុកនៅ -20 ℃ក្នុងរយៈពេលយូរ។
PCR Rសកម្មភាព៖
1.ការរៀបចំល្បាយប្រតិកម្ម
| សមាសធាតុ | ការប្រមូលផ្តុំ |
| 10 × PCR Buffer (dNTP ឥតគិតថ្លៃ, Mg²+ ឥតគិតថ្លៃ) | 1 × |
| dNTPs (10mM នីមួយៗ dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 ម។ |
| តាក DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| ថ្នាំ primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| ថ្នាំ primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| គំរូក | ≤10% ដំណោះស្រាយប្រតិកម្មសង្វាក់ទីមួយ (2 μL) |
| ddH2O | ទៅ 50 μL |
កំណត់ចំណាំ៖ក៖ ប្រសិនបើដំណោះស្រាយប្រតិកម្មសង្វាក់ទីមួយត្រូវបានបន្ថែមច្រើនពេក ប្រតិកម្ម PCR អាចត្រូវបានរារាំង។
2.នីតិវិធីប្រតិកម្ម PCR
| ជំហាន | សីតុណ្ហភាព | ពេលវេលា | វដ្ត |
| មុន denaturation | ៩៥ អង្សាសេ | 2-5 នាទី។ | 1 |
| ការប្រែពណ៌ | ៩៥ អង្សាសេ | 10-20 វិ | ៣០-៤០ |
| ការស្រើបស្រាល | 50-60 ℃ | 10-30 វិ | |
| ផ្នែកបន្ថែម | ៧២ អង្សាសេ | 10-60 វិ |
កំណត់ចំណាំ
1.ស័ក្តិសមសម្រាប់ការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពសីតុណ្ហភាពប្រតិចារិកបញ្ច្រាសក្នុងជួរ 42 ℃ ~ 55 ℃។
2.វាមានស្ថេរភាពប្រសើរជាងមុន សាកសមសម្រាប់ការពង្រីកការចម្លងបញ្ច្រាសសីតុណ្ហភាពខ្ពស់។លើសពីនេះទៀតវាអំណោយផលសម្រាប់ការឆ្លងកាត់តំបន់រចនាសម្ព័ន្ធស្មុគស្មាញនៃ RNA ប្រកបដោយប្រសិទ្ធភាព។ផងដែរ, វា។ស័ក្តិសមសម្រាប់ការរកឃើញ RT-PCR បរិមាណ fluorescence multiplex មួយជំហាន។
3.ភាពឆបគ្នាល្អជាមួយអង់ស៊ីមពង្រីក PCR ផ្សេងៗ និងសមរម្យសម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-PCR ដែលមានប្រតិកម្មខ្ពស់។
4.ស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រតិកម្ម RT-PCR កម្រិតមួយជំហានដែលមានភាពប្រែប្រួលខ្ពស់ ធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវអត្រារកឃើញនៃកំហាប់ទាបនៃគំរូ។
5.សាកសមសម្រាប់ការសាងសង់បណ្ណាល័យ cDNA ។
