កញ្ចប់តូចស្រង់ DNA
កញ្ចប់នេះទទួលយកប្រព័ន្ធបណ្ដោះអាសន្នដែលប្រសើរឡើង និងបច្ចេកវិទ្យាបន្សុតជួរឈរស៊ីលីកាជែល ដែលអាចយកមកវិញនូវបំណែក DNA 70 bp - 20 kb ពីការប្រមូលផ្តុំផ្សេងៗនៃ TAE ឬ TBE agarose gel ។ជួរឈរ adsorption DNA អាចពិសេស adsorp DNA នៅក្រោមលក្ខខណ្ឌអំបិលខ្ពស់។លើសពីនេះ កញ្ចប់នេះអាចបន្សុទ្ធបំណែក DNA ដោយផ្ទាល់ពីផលិតផល PCR ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអង់ស៊ីម ឬផលិតផល DNA ឆៅដែលទទួលបានដោយវិធីសាស្រ្តផ្សេងទៀត និងយកសារធាតុមិនបរិសុទ្ធដូចជាប្រូតេអ៊ីន សមាសធាតុសរីរាង្គផ្សេងទៀត អ៊ីយ៉ុងអំបិលអសរីរាង្គ និងសារធាតុ primers oligonucleotide។វាអាចធានាថាការបន្សុតអាចត្រូវបានបញ្ចប់ក្នុងរយៈពេល 10-15 នាទី។DNA ដែលបន្សុតអាចប្រើដោយផ្ទាល់សម្រាប់ ligation, transformation, enzyme digestion, in vitro transcription, PCR, sequencing, microinjection ជាដើម។
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
រក្សាទុកនៅ -15 ~ -25 ℃ និងដឹកជញ្ជូននៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
សមាសធាតុ
| សមាសធាតុ | (100 rxns) |
| Buffer GDP | 80 មីលីលីត្រ |
| Buffer GW | 2 × 20 មីលីលីត្រ |
| Elution Buffer | 20 មីលីលីត្រ |
| FastPure DNA Mini Columns-G | ១០០ |
Buffer GDP៖សតិបណ្ដោះអាសន្ននៃការភ្ជាប់ DNA ។
Buffer GW៖ការលាងសតិបណ្ដោះអាសន្ន;បន្ថែមអេតាណុលដាច់ខាតតាមបរិមាណដែលបានបញ្ជាក់នៅលើដបមុនពេលប្រើ។
Elution Buffer៖Elution។
FastPure DNA Mini Columns-G៖ជួរឈរស្រូបយក DNA ។
បំពង់ប្រមូល 2 មីលីលីត្រ:បំពង់ប្រមូលសម្រាប់ច្រោះ។
សម្ភារៈរៀបចំ
បំពង់មាប់មគ 1.5 មីលីលីត្រ អេតាណុលដាច់ខាត និងអ៊ីសូប្រូផាណុល (នៅពេលដែលបំណែក DNA ≤100 bp បន្ថែមបរិមាណ 1
isopropanol ទៅ 1 បរិមាណជែល), ទឹកងូតទឹក។
ដំណើរការពិសោធន៍
បន្ថែម 80 មីលីលីត្រនៃអេតាណុលដើម្បីពនឺ Buffer GW ដូចដែលបានបង្ហាញនៅលើស្លាកមុនពេលប្រើ រក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
យន្តការ
1. ដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម PCR
គ្រោងការណ៍ទាញយកជែល: បន្ថែមបរិមាណស្មើគ្នា Buffer GDP PCR គម្រោងការស្ដារឡើងវិញនូវដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម៖បន្ថែម 5 ដងនៃបរិមាណ Buffer
2. GDP គណនាបរិមាណជែល (100 μលីត្រ ស្មើនឹង 100 មីលីក្រាម)
រំលាយជែល
3. Preheat នៅ 50 ~ 55℃
4. ចងលាង
បន្ថែម 300 μL នៃ Buffer GDP*
បន្ថែម 700 μLនៃ Buffer GW
បន្ថែម 700 μLនៃ Buffer GW
5. លើកតម្កើង
បន្ថែម 20 - 30μL នៃ Elution Buffer ឬទឹក deionized
កំណត់សម្គាល់* ការស្តារសារធាតុរាវប្រតិកម្ម PCR ដោយគ្មានជំហាននេះ។
កម្មវិធីទាញយកជែល
1. បន្ទាប់ពី DNA electrophoresis សម្រាប់ប្រភាគបំណែក DNA ដកបំណែក DNA តែមួយឆ្នូតចេញពី agarose gel ក្រោមពន្លឺ UV។វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យប្រើក្រដាសស្រូបយកដើម្បីស្រូបយកសំណើមជាក់ស្តែងនៃជែល និងកាត់បន្ថយទំហំនៃបន្ទះជែលដោយយក agarose បន្ថែមតាមដែលអ្នកអាចធ្វើបាន។ថ្លឹងដុំជែល (ដោយគ្មានបំពង់ microcentrifuge) ដើម្បីគណនាបរិមាណរបស់វា៖ បរិមាណ gelslice 100 mg គឺប្រហែល 100 μL ដោយសន្មត់ថាដង់ស៊ីតេគឺ 1g/ml ។
2. បន្ថែមបរិមាណស្មើគ្នា Buffer GDP, incubate នៅ 50 ~ 55 ℃ សម្រាប់ 7-10 នាទី (យោងទៅតាមទំហំជែល, លៃតម្រូវពេលវេលា incubation រហូតដល់ជែលរំលាយទាំងស្រុង) ។បង្វែរបំពង់ 2 ដងក្នុងអំឡុងពេល incubation ។
Δ ការបន្ថែមបរិមាណ 1-3 នៃ Buffer GDP នឹងមិនមានឥទ្ធិពលលើប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារ DNA ទេ។ប្រសិនបើបំណែក DNA ដែលត្រូវយកមកវិញ <100 bp នោះ Buffer GDP ចំនួន 3 ចាំបាច់ត្រូវបន្ថែម។នៅពេលដែលចំណិតជែលបានរំលាយទាំងស្រុងបន្ថែម 1 ភាគនៃ isopropanol និងលាយយ៉ាងហ្មត់ចត់បន្ទាប់មកបន្តទៅជំហានបន្ទាប់។
3. Centrifuge ដោយសង្ខេបដើម្បីនាំយកគំរូទៅបាតនៃបំពង់ បញ្ចូល FastPure DNA Mini Columns-G ទៅក្នុង Collection Tubes 2 ml ដោយប្រុងប្រយ័ត្នផ្ទេរដំណោះស្រាយអតិបរមា 700 μL ម្តង។
ពេលវេលាទៅជួរឈរចម្រោះ, កណ្តាលនៅ 12,000 rpm (13,800 X ក្រាម) សម្រាប់ 30-60 វិ។
4. បោះចោលតម្រង ហើយបន្ថែម 300 μL នៃ Buffer GDP ទៅក្នុងជួរឈរ ញាស់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 1 នាទី centrifuge នៅ 12,000 rpm (13,800 X g) រយៈពេល 30-60 វិ។
5. បោះចោលតម្រង ហើយបន្ថែម Buffer GW ចំនួន 700 μL (ពិនិត្យមើលថាតើអេតាណុលដាច់ខាតត្រូវបានបន្ថែមជាមុន!) ទៅជួរឈរ centrifuge នៅ 12,000 rpm (13,800 X g) រយៈពេល 30-60 វិ។
Δ សូមបន្ថែម Buffer GW ជុំវិញជញ្ជាំងជួរឈរ adsorption ឬបន្ថែម Buffer GW គម្របខាងក្រោយ ហើយលាយវាបញ្ច្រាស់គ្នា 2 – 3 ដង ដើម្បីជួយលាងអំបិលទាំងស្រុងដែលជាប់នឹងជញ្ជាំងបំពង់។
6. ធ្វើជំហានទី 5 ម្តងទៀត។
Δ Flushing ជាមួយ Buffer GW ពីរដងអាចធានាថាអំបិលត្រូវបានដកចេញទាំងស្រុង និងលុបបំបាត់ផលប៉ះពាល់លើការពិសោធន៍ជាបន្តបន្ទាប់។
7. បោះចោលតម្រង ហើយដាក់កណ្តាលជួរឈរទទេនៅ 12,000 rpm (13,800 X g) រយៈពេល 2 នាទី។
8. បញ្ចូលជួរឈរទៅក្នុងបំពង់ microcentrifuge ស្អាត 1.5 មីលីលីត្រ បន្ថែម 20 - 30 μL នៃ Elution Buffer ទៅកណ្តាលនៃភ្នាសជួរឈរ ញាស់រយៈពេល 2 នាទី ហើយបន្ទាប់មក centrifuge នៅ 12,000 rpm (13,800 X g) រយៈពេល 1 នាទី។បោះបង់ជួរឈរ រក្សាទុក DNA ដែលទទួលបាននៅ -20 ។
Δ ការផ្ទេរអតិផរណានៃជំហានទី 8 ទៅកាន់ជួរឈរដើម្បីបន្លឺម្តងទៀត និងកំដៅ Elution Buffer ដល់ 55 (នៅពេលបំណែក DNA >3 kb) ប្រហែលជាមានប្រយោជន៍ក្នុងការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញ។
កម្មវិធីស្តារផលិតផល PCR
ពិធីសារនេះអាចអនុវត្តបានដើម្បីបន្សុទ្ធបំណែក DNA ពីផលិតផល PCR ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអង់ស៊ីម និងផលិតផលឆៅ DNA ផ្សេងទៀត (រួមទាំង DNA ហ្សែន)។ដំណោះស្រាយនេះអាចកម្ចាត់ nucleotides, primers, primer dimers, ម៉ូលេគុលអំបិល, អង់ស៊ីម និងសារធាតុមិនបរិសុទ្ធផ្សេងៗយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។
1. សង្ខេបផលិតផល PCR centrifuge ដំណោះស្រាយប្រតិកម្មអង់ស៊ីម និងផលិតផលឆៅ DNA ផ្សេងទៀត។ប៉ាន់ប្រមាណបរិមាណរបស់វាជាមួយ pipette និងផ្ទេរទៅបំពង់ 1.5ml ឬ 2ml មាប់មគ។បន្ថែម ddH2O រហូតដល់បរិមាណរហូតដល់ 100 μL;ខណៈពេលដែលសម្រាប់ DNA ហ្សែនជាមួយនឹងការប្រមូលផ្តុំខ្ពស់ ការពនរទៅ 300 μL ជាមួយ ddH2O នឹងជួយបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញ។
2. បន្ថែមបរិមាណ 5 នៃ Buffer GDP លាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់ដោយការដាក់បញ្ច្រាស ឬ vortexing ។ប្រសិនបើបំណែក DNA នៃចំណាប់អារម្មណ៍> 100 bp បរិមាណបន្ថែម 1.5 (គំរូ + Buffer GDP) នៃអេតាណុលត្រូវបន្ថែម។
3. បញ្ចូលជួរឈរត្រឡប់មកវិញទៅក្នុងបំពង់ប្រមូលផ្ដុំ ផ្ទេរ mixtrue ទៅជួរឈរ centrifuge នៅ 12,000 rpm (13,800 ×g) សម្រាប់ 30 - 60 វិ។ប្រសិនបើបរិមាណនៃដំណោះស្រាយចម្រុះគឺ> 700 µL ដាក់ជួរឈរ adsorption ត្រឡប់ទៅបំពង់ប្រមូលវិញ ផ្ទេរដំណោះស្រាយដែលនៅសល់ទៅជួរឈរ adsorption និង centrifuge នៅ 12,000 rpm (13,800 × g) រយៈពេល 30 - 60 វិ។
4. ការអនុវត្តបន្ទាប់សំដៅលើជំហានទី 5 – 8 នៃ 08- 1/កម្មវិធីទាញយកជែល។
កម្មវិធី
ការប្រមូលផ្តុំផ្សេងៗនៃ TAE ឬ TBE agarose gel;ផលិតផល PCR ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអង់ស៊ីម ឬផលិតផល DNA ឆៅផ្សេងទៀតដែលទទួលបានដោយវិធីសាស្ត្រផ្សេងៗ។បំណែកដែលបានរកឃើញវិញមានចាប់ពី70 bp -20 kb ។
កំណត់ចំណាំ
សម្រាប់តែការស្រាវជ្រាវប៉ុណ្ណោះ។មិនមែនសម្រាប់ប្រើក្នុងដំណើរការរោគវិនិច្ឆ័យទេ។
1. បន្ថែម 80 មីលីលីត្រនៃអេតាណុលដើម្បីពនឺ Buffer GW ដូចដែលបានបង្ហាញនៅលើស្លាកមុនពេលប្រើ រក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
2. ប្រសិនបើ Buffer GDP ងាយធ្លាក់ក្នុងកំឡុងពេលផ្ទុកសីតុណ្ហភាពទាប វាអាចត្រូវបានដាក់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងរយៈពេលមួយមុនពេលប្រើប្រាស់។បើចាំបាច់ វាអាចត្រូវបានកំដៅក្នុងអាងងូតទឹក 37 ℃ រហូតទាល់តែទឹកភ្លៀងត្រូវបានរំលាយទាំងស្រុង ហើយបន្ទាប់មកវាអាចប្រើបានបន្ទាប់ពីលាយ។
3. កំណត់សីតុណ្ហភាពក្នុងអាងងូតទឹកដល់ 50 ~ 55 ℃ជាមុន។
4. នៅក្នុងកម្មវិធី 08-1/Gel extraction program ជំហានទី 1 ការបង្រួមទំហំរបស់ Gel slice នឹងកាត់បន្ថយពេលវេលារំលាយយ៉ាងសំខាន់ និងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារឡើងវិញ (Linearized DNA គឺងាយស្រួលធ្វើ hydrolyze នៅពេលដែលត្រូវបានប៉ះពាល់ជាបន្តបន្ទាប់នៅសីតុណ្ហភាពខ្ពស់)។កុំបញ្ចេញ DNA gel ទៅនឹងកាំរស្មីយូវីក្នុងរយៈពេលយូរ ព្រោះពន្លឺអ៊ុលត្រាវីយូឡេអាចបណ្តាលឱ្យខូច DNA ។
5. រំលាយជែលក្នុង 08- 1/កម្មវិធីទាញយកជែលជំហានទី 2 ទាំងស្រុង បើមិនដូច្នោះទេ ប្រសិទ្ធភាពនៃការស្តារ DNA នឹងរងផលប៉ះពាល់យ៉ាងធ្ងន់ធ្ងរ។
6. Preheat Elution Buffer ឬ ddH2O ដល់ 55 ℃ ដែលមានប្រយោជន៍ក្នុងការកែលម្អប្រសិទ្ធភាព elution DNA ។វាត្រូវបានណែនាំអោយរក្សាទុក DNA ក្នុងកម្រិត 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 - 8.5 ។
