ថ្នាំទប់ស្កាត់ Rnase
Murine RNase inhibitor គឺជាថ្នាំទប់ស្កាត់ murine RNase ផ្សំឡើងវិញដែលបានបង្ហាញ និងបន្សុតចេញពី E.coli ។វាភ្ជាប់ទៅនឹង RNase A, B ឬ C ក្នុងសមាមាត្រ 1: 1 តាមរយៈការភ្ជាប់មិនមែន covalent ដោយហេតុនេះរារាំងសកម្មភាពរបស់អង់ស៊ីមទាំងបី និងការពារ RNA ពីការរិចរិល។ទោះយ៉ាងណាក៏ដោយ វាមិនមានប្រសិទ្ធភាពប្រឆាំងនឹង RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H ឬ RNase ពី Aspergillus ទេ។ថ្នាំទប់ស្កាត់ Murine RNase ត្រូវបានធ្វើតេស្តដោយ RT-PCR, RT-qPCR និង IVT mRNA ហើយត្រូវគ្នាជាមួយការចម្លងបញ្ច្រាសពាណិជ្ជកម្មផ្សេងៗ DNA polymerases និង RNA polymerases ។
បើប្រៀបធៀបទៅនឹងថ្នាំទប់ស្កាត់ RNase របស់មនុស្ស ថ្នាំ murine RNase inhibitor មិនមានផ្ទុក cysteine ពីរដែលងាយនឹងអុកស៊ីតកម្មដែលបណ្តាលឱ្យអសកម្មនៃសារធាតុ inhibitor ។ដែលធ្វើឱ្យវាមានស្ថេរភាពនៅកំហាប់ទាបនៃ DTT (តិចជាង 1 mM) ។លក្ខណៈពិសេសនេះធ្វើឱ្យវាស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រើក្នុងប្រតិកម្មដែលកំហាប់ខ្ពស់នៃ DTT គឺមិនល្អចំពោះប្រតិកម្ម (ឧទាហរណ៍ RT-PCR ពេលវេលាពិត)។
Aកម្មវិធី
ផលិតផលនេះអាចត្រូវបានប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងការពិសោធន៍ណាមួយដែលការជ្រៀតជ្រែក RNase គឺអាចធ្វើទៅបានដើម្បីជៀសវាងការរិចរិល RNA ដូចជា៖
1.ការសំយោគខ្សែទីមួយនៃ cDNA, RT-PCR, RT-qPCR ជាដើម។
2.ការពារ RNA ពីការរិចរិលក្នុងអំឡុងពេលការចម្លង/ការបកប្រែនៅក្នុង vitro (ឧ. ប្រព័ន្ធចម្លងមេរោគ in vitro)។
3.ការទប់ស្កាត់សកម្មភាព RNase កំឡុងពេលបំបែក និងបន្សុត RNA ។
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
ផលិតផលអាចរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25～-15 ℃ មានសុពលភាព 2 ឆ្នាំ។
សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្ទុក
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 mM DTT និង 50% glycerol ។
និយមន័យឯកតា
បរិមាណនៃ murine RNase inhibitor ដែលត្រូវការដើម្បីរារាំងសកម្មភាពនៃ 5ng នៃ ribonuclease A ដោយ 50% ត្រូវបានកំណត់ជាឯកតាមួយ (U) ។
ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីន
ទំងន់ម៉ូលេគុលនៃ murine RNase inhibitor គឺ 50 kDa ។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
Exonuclease សកម្មភាព៖
40 U នៃ murine RNase inhibitor ជាមួយនឹង 1 μg λ -Hind III រំលាយ DNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
សកម្មភាព Endonuclease៖
40 U នៃ murine RNase inhibitor ជាមួយនឹង 1μ g λ DNA នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនរសាយដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
នីក សកម្មភាព៖
40U នៃ murine RNase inhibitor ជាមួយ 1μg pBR322 នៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 16 ម៉ោង ផ្តល់លទ្ធផលមិនរសាយដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
RNase សកម្មភាព:
40U នៃ murine RNase inhibitor ជាមួយនឹង 1.6μ g MS2 RNA សម្រាប់ 4 ម៉ោងនៅ 37 ℃ ផ្តល់លទ្ធផលមិនមានការរិចរិលដូចដែលបានកំណត់ដោយ agarose gel electrophoresis ។
E.coli DNA:
40 U នៃ murine RNase inhibitor ត្រូវបានពិនិត្យរកមើលវត្តមានរបស់ E. coli genomic DNA ដោយប្រើ TaqMan qPCR ជាមួយនឹង primers ជាក់លាក់សម្រាប់ទីតាំង E. coli 16S rRNA ។ការចម្លងរោគ DNA ហ្សែន E. coli គឺ ≤ 0.1 pg/40 U ។
Notes
1. ការយោលដោយហឹង្សា ឬការកូរនឹងនាំអោយអង់ស៊ីមអសកម្ម។
2. ជួរសីតុណ្ហភាពល្អបំផុតនៃសារធាតុ inhibitor គឺ 25-55 ℃ ហើយវាត្រូវបានអសកម្មនៅសីតុណ្ហភាព 65 ℃ និងខ្ពស់ជាងនេះ។
សកម្មភាពរបស់ RNase H, RNase 1 និង RNase T1 មិនត្រូវបានរារាំងដោយ murine RNase inhibitor ទេ។
4. ការទប់ស្កាត់សកម្មភាព RNase ត្រូវបានរកឃើញនៅក្នុងជួរដ៏ធំទូលាយនៃ pH (pH 5-9 គឺសកម្មទាំងអស់) ហើយសកម្មភាពខ្ពស់បំផុតត្រូវបានគេសង្កេតឃើញនៅ pH 7-8 ។
5.ចាប់តាំងពី ribonucleases ជាធម្មតារក្សាសកម្មភាពនៅក្រោមលក្ខខណ្ឌ denaturing ត្រូវតែយកចិត្តទុកដាក់ដើម្បីជៀសវាង denaturing ម៉ូលេគុល RNase Inhibitor ដែលស្មុគស្មាញជាមួយ ribonuclease មួយ។ដើម្បីបងា្ករការបញ្ចេញសារធាតុ ribonuclease សកម្ម សីតុណ្ហភាពលើសពី 50 °C និងកំហាប់ខ្ពស់នៃអ៊ុយ ឬសារធាតុ denaturing ផ្សេងទៀតគួរតែត្រូវបានជៀសវាង។
