ឧបករណ៍ PCR ផ្ទាល់របស់រុក្ខជាតិ

លេខឆ្មា៖ HCR2020A

Plant Direct PCR Kit គឺស័ក្តិសមសម្រាប់ការពង្រីកដោយផ្ទាល់នៃស្លឹករុក្ខជាតិ គ្រាប់ពូជ។ល។ ហើយអាចប្រើសម្រាប់ការពិនិត្យដោយលទ្ធផលខ្ពស់នៃគំរូរុក្ខជាតិដែលមិនមានសារធាតុ polysaccharides និង polyphenols។ការពង្រីកដោយផ្ទាល់ DNA polymerase ដោយផ្អែកលើការវិវត្តដែលដឹកនាំមានការអត់ធ្មត់ខ្ពស់ចំពោះ PCR inhibitors នៅក្នុងរុក្ខជាតិ។ទន្ទឹមនឹងនេះដែរ វារក្សាបាននូវដំណើរការ amplification ខ្ពស់ ដែលសមរម្យសម្រាប់ការពង្រីកនៃបំណែក DNA ក្នុងរង្វង់ 5 kb ។សារធាតុ Lysis buffer A ដែលមានតែមួយគត់នៅក្នុងកញ្ចប់អាចប្រើដើម្បី lyse ជាលិការុក្ខជាតិស្រស់ ឬកក។វាងាយស្រួលក្នុងការដំណើរការ ហើយ lysate អាចត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ការពង្រីកដោយគ្មានការបន្សុត។ប្រព័ន្ធនេះមានភ្នាក់ងារការពារដែលអាចឱ្យសំណាកឆៅត្រូវបានពង្រីកយ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព បន្ទាប់ពីត្រជាក់ និងរលាយម្តងហើយម្តងទៀត។2 × Plant Direct Master Mix ត្រូវការតែបន្ថែម primers និង templates ដើម្បីអនុវត្តប្រតិកម្ម amplification ដោយហេតុនេះកាត់បន្ថយប្រតិបត្តិការ pipetting និងធ្វើអោយប្រសើរឡើងនូវដំណើរការរាវរក និងការផលិតឡើងវិញនៃលទ្ធផល។

សមាសធាតុ

*Plant Direct Lysis Buffer B គឺជា reagent ស្រេចចិត្ត ដែលត្រូវបានប្រើដើម្បីបន្សាប Plant Direct Lysis Buffer A សម្រាប់ការអូសបន្លាយពេលវេលាផ្ទុកគំរូ។វា​អាច​ប្រើ​បាន​តាម​ស្ថានភាព​ជាក់ស្តែង។

លក្ខខណ្ឌផ្ទុក

2 × Plant Direct Master Mix រក្សាទុកនៅ -30 ~ -15 ℃ និងជៀសវាងការបង្កកនិងរលាយម្តងហើយម្តងទៀត;ដាំ Lysis Buffer ដោយផ្ទាល់ ទុកនៅ -30 ~ -15 ℃ ឬ 2 ~ 8 ℃ ។

ដំណើរការពិសោធន៍

ដំណើរការគំរូ–ស្លឹករុក្ខជាតិ

វិធីសាស្រ្តផ្ទាល់៖វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើស្លឹកខ្ចី។ប្រើកណ្តាប់ដៃរន្ធដែលមានអង្កត់ផ្ចិតថេរ 0.5 - 3 មីលីម៉ែត្រដើម្បីទទួលបានគំរូតូចនិងឯកសណ្ឋានហើយបន្ទាប់មកបន្ថែមគំរូដោយផ្ទាល់ទៅប្រព័ន្ធ PCR (ប្រព័ន្ធ 50 μlត្រូវបានណែនាំ) ។ចំណាំ ត្រូវប្រាកដថាគំរូស្ថិតនៅក្នុងដំណោះស្រាយ PCR ហើយមិនប្រឆាំងនឹងជញ្ជាំងបំពង់ទេ។ប្រសិនបើ PCR ផ្ទាល់ត្រូវបានប្រើដើម្បីពង្រីកបំណែកវែងៗ និងគំរូស្មុគ្រស្មាញ ការប្រើគំរូដែលមានអង្កត់ផ្ចិតតូចជាង (0.5 - 1 mm) ជាគំរូអាចជួយឱ្យទទួលបានលទ្ធផលប្រសើរជាងមុន។

វិធីសាស្រ្តនៃការកិនលីហ្សីសៈវាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើស្លឹកខ្ចី។យកស្លឹកតូចមួយ (អង្កត់ផ្ចិតប្រហែល ១-៣ម.ម) ដាក់វាក្នុង 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab ហើយកិនវាឱ្យបានច្រើនតាមដែលអាចធ្វើបាន (ជំហាននេះអាចធ្វើបានដោយការច្របាច់ស្លឹកដោយចុងបំពង់ 100 μl។ ដើម្បីកិនគំរូ) ។ប្រសិនបើទំហំធំនៃជាលិកាស្លឹកត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ (មិនលើសពី 7 មីលីម៉ែត្រ) បង្កើនបរិមាណនៃសារធាតុរំលាយទៅ 50 μl។បន្ទាប់ពីស្លឹកត្រូវបានដីដំណោះស្រាយគួរតែមានពណ៌បៃតង។បន្ទាប់​ពី​ការ​ផ្ចិត​ផ្ចង់​មួយ​រយៈ​ខ្លី បន្ថែម 1 μl នៃ supernatant ទៅ​ប្រព័ន្ធ PCR ជា​គំរូ​ប្រតិកម្ម។

វិធីសាស្រ្តនៃការវិភាគកម្ដៅ៖វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើស្លឹកខ្ចី។យកស្លឹកតូចមួយ (អង្កត់ផ្ចិតប្រហែល 1 - 3 ម) ដាក់វានៅក្នុង 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A ហើយកំដៅវានៅ 95 ° C រយៈពេល 5 - 10 នាទី។ពេលវេលាលីហ្សីអាចពង្រីកបានយ៉ាងសមរម្យសម្រាប់ស្លឹកដែលពិបាកក្នុងការលីស (មិនលើសពី 20 នាទី)។ប្រសិនបើទំហំធំនៃជាលិកាស្លឹកត្រូវបានគេប្រើប្រាស់ (មិនលើសពី 7 មីលីម៉ែត្រ) បង្កើនបរិមាណនៃសារធាតុរំលាយទៅ 50 μl។បន្ទាប់ពីកំដៅ រំកិល centrifuge មួយរយៈខ្លី ហើយបន្ថែម 1 μl នៃ supernatant ទៅប្រព័ន្ធ PCR ជាគំរូប្រតិកម្ម។

ដំណើរការគំរូ- គ្រាប់ពូជរុក្ខជាតិ

វិធីសាស្រ្តនៃការកិនលីហ្សីសៈប្រើស្បែកក្បាលដើម្បីកាត់គ្រាប់ពូជដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 5 មីលីម៉ែត្រ បន្ថែមពួកវាទៅក្នុង 100 μl នៃ Plant Direct Lysis Buffer A ហើយកិនសំណាកដោយម្ជុលបំពង់ ឬឧបករណ៍ផ្សេងទៀត។Vortex ក្នុងរយៈពេលខ្លី ហើយទុកឱ្យឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 3-5 នាទី។ត្រូវប្រាកដថាសំណាកគ្រាប់ពូជត្រូវលិចក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន។បន្ទាប់ពីការផ្ចិតផ្ចង់មួយភ្លែត បន្ថែម 1 μl នៃ supernatant ទៅប្រព័ន្ធ PCR ជាគំរូប្រតិកម្ម។

វិធីសាស្រ្តនៃការវិភាគកម្ដៅ៖ប្រើស្បែកក្បាលកាត់គ្រាប់ពូជដែលមានអង្កត់ផ្ចិត 5 មីលីម៉ែត្រ បន្ថែមវាទៅក្នុង 100 μl នៃ Plant Direct Lysis Buffer A ហើយកំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 95 អង្សារសេរយៈពេល 5 ទៅ 10 នាទី។ពេលវេលាលីហ្សីអាចពង្រីកបានយ៉ាងសមរម្យសម្រាប់ស្លឹកដែលពិបាកក្នុងការលីស (មិនលើសពី 30 នាទី)។បន្ទាប់ពីកំដៅរួច ច្របាច់កណ្តាលដោយសង្ខេប និងបន្ថែម 1 μl supernatant ទៅប្រព័ន្ធ PCR ជាគំរូប្រតិកម្ម។

ក.កន្ត្រៃ ឬឧបករណ៍ផ្សេងទៀតក៏អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកាត់សំណាកដែលមានទំហំសមស្រប។ប្រសិនបើកណ្តាប់ដៃ ឬកន្ត្រៃត្រូវបានប្រើប្រាស់ឡើងវិញ ពួកគេគួរតែត្រូវបានសម្អាតជាមួយនឹងដំណោះស្រាយ 2% sodium hypochlorite មុនពេលប្រើប្រាស់នីមួយៗដើម្បីការពារការចម្លងរោគរវាងគំរូ។

ខ.សូមប្រាកដថា Plant Direct Lysis Buffer ត្រូវបានរលាយទាំងស្រុងមុនពេលប្រើប្រាស់។ប្រសិនបើទ្រនាប់មានជាតិ viscous ឬមានទឹកភ្លៀង វាអាចត្រូវបានកំដៅនៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ ដើម្បីរលាយវាទាំងស្រុងមុនពេលប្រើប្រាស់។

គ.បរិមាណនៃគំរូនៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្មអាចត្រូវបានកែតម្រូវដោយសមរម្យយោងទៅតាមភាពខុសគ្នានៃបរិមាណនៃសម្ភារៈរុក្ខជាតិនិងសារធាតុបន្ថែម។

រោងចក្រ Lysis Buffer ផ្ទាល់

Plant Direct Lysis Buffer A ដែលមាននៅក្នុងផលិតផលនេះត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងយ៉ាងតឹងរ៉ឹងដើម្បីបញ្ចេញហ្សែននៃជាលិការុក្ខជាតិភាគច្រើន និងសមរម្យសម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលខ្លីនៃរុក្ខជាតិឆៅនៅសីតុណ្ហភាព 4 ℃។ប្រសិនបើសំណាកគំរូត្រូវរក្សាទុកក្នុងរយៈពេលយូរ (ឧទាហរណ៍ 1 - 2 ខែ) វាត្រូវបានណែនាំឱ្យផ្ទេរ supernatant ទៅបំពង់ EP ថ្មី ហើយរក្សាទុកវានៅ -20 ℃។ដើម្បីទុកសំណាកឱ្យកាន់តែមានស្ថេរភាព បន្ថែមបរិមាណស្មើគ្នានៃ Plant Direct Lysis Buffer B ទៅក្នុង supernatant ដែលបានផ្ទេរ លាយឱ្យល្អហើយទុកនៅ -20 ℃។ពេលវេលាផ្ទុកមានស្ថេរភាពប្រែប្រួលទៅតាមគំរូ និងស្ថានភាពរុក្ខជាតិ។

ប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម

ក.វាមាន Mg²⁺នៅកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 2 mM ។

ខ.វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យប្រើកំហាប់ចុងក្រោយនៃ 0.4μM សម្រាប់ primer នីមួយៗ។ការប្រើប្រាស់ថ្នាំ primers ច្រើនពេកនឹងនាំឱ្យមានការកើនឡើងនៃ amplification ដែលមិនជាក់លាក់។

គ.បរិមាណសំណាកដែលប្រើអាចកែតម្រូវទៅតាមស្ថានភាពជាក់ស្តែង។បរិមាណដែលបានប្រើក្នុងប្រតិកម្មតែមួយនៃសំណាក lysed ឆៅអាចត្រូវបានកែតម្រូវចន្លោះពី 2% ទៅ 20% នៃបរិមាណសរុបនៃប្រតិកម្ម។ការប្រើសំណាកច្រើនពេកអាចបណ្តាលឱ្យបរាជ័យក្នុងការពង្រីក។

កម្មវិធីប្រតិកម្ម

ក.Initial Denaturation (98 ℃, 5 នាទី) លើកកំពស់ lysis នៃជាលិការុក្ខជាតិ បញ្ចេញ DNA ហ្សែន ដែលអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR ។កុំបន្ថយពេលវេលា ឬបន្ថយសីតុណ្ហភាព។

ខ.វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យកំណត់វាស្មើនឹងតម្លៃ primer Tm ឬ 2 ~ 4 ℃ខ្ពស់ជាងតម្លៃ Tm ។ការពង្រីកដោយផ្ទាល់ DNA polymerase ដែលប្រើក្នុងផលិតផលនេះគឺខុសពី Taq DNA polymerase ធម្មតា ហើយមានតម្រូវការពិសេសសម្រាប់សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្ម; ការប្រើប្រាស់សីតុណ្ហភាព annealing ខ្ពស់អាចកាត់បន្ថយការពង្រីកមិនជាក់លាក់ និងបង្កើនប្រសិទ្ធភាព amplification យ៉ាងមានប្រសិទ្ធភាព។សម្រាប់គំរូស្មុគ្រស្មាញ ការពង្រីកដ៏មានប្រសិទ្ធិភាពអាចត្រូវបានសម្រេចដោយការលៃតម្រូវសីតុណ្ហភាព annealing និងការអូសបន្លាយពេលវេលា។

គ.ប្រសិនបើប្រវែងនៃផលិតផលពង្រីកគឺ ≤1 kb នោះរយៈពេលបន្ថែមត្រូវបានកំណត់នៅ 30 វិ/គីឡូបៃ។ប្រសិនបើប្រវែងនៃផលិតផលពង្រីកគឺ> 1 kb នោះពេលវេលាបន្ថែមត្រូវបានកំណត់នៅ 60 វិ/គីឡូបៃ។

ឃ.សម្រាប់គំរូស្មុគ្រស្មាញ ឬគំរូដែលមានទិន្នផល amplification ទាប ចំនួននៃវដ្តអាចត្រូវបានកើនឡើងយ៉ាងសមរម្យដល់ 40 -50 វដ្ត។

កម្មវិធី

វាអាចអនុវត្តបានសម្រាប់ការពង្រីកដោយផ្ទាល់នៃជាលិការុក្ខជាតិ និងការពិនិត្យតាមរយៈកម្រិតខ្ពស់នៃគំរូរុក្ខជាតិដែលមិនមានសារធាតុ polysaccharides និង polyphenols។

កំណត់ចំណាំ

សម្រាប់តែការស្រាវជ្រាវប៉ុណ្ណោះ។មិនមែនសម្រាប់ប្រើក្នុងដំណើរការរោគវិនិច្ឆ័យទេ។

1. សម្រាប់ការពង្រីករុក្ខជាតិឆៅ ឬការពង្រីកដោយផ្ទាល់ វាត្រូវបានណែនាំឱ្យប្រើ DNA ហ្សែនដែលបានបន្សុតជាការត្រួតពិនិត្យជាវិជ្ជមាន មុនពេលចាប់ផ្តើមការពិសោធន៍ ដើម្បីធានាថាប្រព័ន្ធ primers និងប្រតិបត្តិការត្រឹមត្រូវ។

2. DNA polymerase ពង្រីកដោយផ្ទាល់ដែលប្រើក្នុងឧបករណ៍នេះមានសកម្មភាពអានភស្តុតាងខ្លាំង។ប្រសិនបើការក្លូន TA ចាំបាច់ត្រូវអនុវត្ត វាត្រូវបានណែនាំអោយសម្អាត DNA មុនពេលបន្ថែមអាដេនីន។

3. ការណែនាំអំពីការរចនាបឋម៖

ក.វាត្រូវបានណែនាំថាមូលដ្ឋានចុងក្រោយនៅចុង 3′ នៃ primer គួរតែជា G ឬ C ។

ខ.ភាពមិនស៊ីគ្នាជាប់គ្នាគួរតែត្រូវបានជៀសវាងនៅក្នុងមូលដ្ឋាន 8 ចុងក្រោយនៅចុង 3′ នៃ primer ។គ.ជៀសវាងរចនាសម្ព័ន្ធសក់នៅចុង 3′ នៃ primer ។

ឃ.ភាពខុសគ្នានៃតម្លៃ Tm នៃ primer ទៅមុខ និង primer បញ្ច្រាសគួរតែមិនលើសពី 1 ℃ ហើយតម្លៃ Tm គួរតែត្រូវបានកែតម្រូវទៅ 60 ~ 72 ℃ ( Primer Premier 5 ត្រូវបានគេណែនាំឱ្យគណនាតម្លៃ Tm ) ។

អ៊ីលំដាប់ primer បន្ថែមដែលមិនត្រូវគ្នានឹងគំរូ មិនគួរត្រូវបានរួមបញ្ចូលនៅពេលគណនាតម្លៃ primer Tm ។

f.វាត្រូវបានណែនាំថាមាតិកា GC នៃ primer នឹងមាន 40% -60% ។

g.ការចែកចាយសរុបនៃ A, G, C និង T នៅក្នុង primer គួរតែមានតាមដែលអាចធ្វើទៅបាន។ជៀសវាងការប្រើតំបន់ដែលមានមាតិកា GC ឬ AT ខ្ពស់។

hជៀសវាងវត្តមាននៃលំដាប់បំពេញបន្ថែមនៃមូលដ្ឋាន 5 ឬច្រើនជាងនេះទាំងនៅក្នុង primer ឬរវាង primers ពីរ ហើយជៀសវាងវត្តមាននៃការបំពេញបន្ថែមនៃ 3 មូលដ្ឋានឬច្រើនជាងនេះនៅចុង 3′ នៃ primers ពីរ។

ខ្ញុំប្រើមុខងារ NCBI BLAST ដើម្បីពិនិត្យមើលភាពជាក់លាក់នៃ primer ដើម្បីការពារ amplification ដែលមិនជាក់លាក់។