RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase គឺជា DNA polymerase ដែលពឹងផ្អែកលើគំរូ RNA ដែលខ្វះសកម្មភាព exonuclease 3'→5' និងមានសកម្មភាព RNase H ។អង់ស៊ីមនេះអាចប្រើ RNA ជាគំរូមួយដើម្បីសំយោគ strand បន្ថែមនៃ DNA ដែលអាចត្រូវបានអនុវត្តចំពោះការសំយោគ cDNA ខ្សែទីមួយ ជាពិសេសសម្រាប់ RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification)។បើប្រៀបធៀបជាមួយ RTL reverse transcriptase 1.0 ភាពប្រែប្រួលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងយ៉ាងខ្លាំង ស្ថេរភាពកម្ដៅកាន់តែរឹងមាំ ហើយប្រតិកម្មនៅសីតុណ្ហភាព 65°C មានស្ថេរភាពជាង។RTL reverse transcriptase (glycerol free) អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីរៀបចំការត្រៀមលក្ខណៈ lyophilized, lyophilized RT-LAMP reagents ជាដើម។
និយមន័យឯកតា
ឯកតាមួយរួមបញ្ចូល 1 nmol នៃ dTTP ទៅក្នុងសម្ភារៈដែលអាចជ្រាបទឹកអាស៊ីតក្នុងរយៈពេល 20 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 50°C ដោយប្រើសារធាតុ poly(A)•oligo(dT)25 ជាគំរូ-primer ។
សមាសធាតុ
| សមាសភាគ | HC5008A-០១ | HC5008A-០២ | HC5008A-០៣ |
| RTL Reverse Transcriptase (គ្មានគ្លីសេរីន) (15U/μL) | 0.1 មីលីលីត្រ | 1 មីលីលីត្រ | 10 មីលីលីត្រ |
| 10 × HC RTL Buffer | 1.5 មីលីលីត្រ | 4 × 1.5 មីលីលីត្រ | 5 × 10 មីលីលីត្រ |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 មីលីលីត្រ | 2 × 1.5 មីលីលីត្រ | 3 × 10 មីលីលីត្រ |
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
ការដឹកជញ្ជូននៅក្រោម 0 ° C និងត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -25 ° C ~ -15 ° C ។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
- សកម្មភាពសំណល់នៃEនដូនុយក្លេស៖ប្រតិកម្ម 50 μL ដែលមាន 1 μg នៃ λDNA និង 15 ឯកតានៃ RTL2.0 incubated សម្រាប់ 16 ម៉ោងនៅ 37 ℃ បង្ហាញលំនាំដូចគ្នានឹងការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានដោយ gel electrophoresis ។
- សកម្មភាពសំណល់នៃExonuclease:ប្រតិកម្ម 50 μL ដែលមាន 1 μg នៃ Hind Ⅲ រំលាយ λDNA និង 15 ឯកតានៃ RTL2.0 incubated សម្រាប់ 16 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ℃ បង្ហាញលំនាំដូចគ្នានឹងការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានដោយ gel electrophoresis ។
- សកម្មភាពសំណល់នៃនីកាស:ប្រតិកម្ម 50 μL ដែលមាន 1 μg នៃ supercoiled pBR322 និង 15 ឯកតានៃ RTL2.0 incubated សម្រាប់រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C បង្ហាញគំរូដូចគ្នានឹងការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានដោយ gel electrophoresis ។
- សកម្មភាពសំណល់នៃRNase:ប្រតិកម្ម 10 μL ដែលមាន 0.48 μg នៃ MS2 RNA និង 15 ឯកតានៃ RTL2.0 incubated សម្រាប់រយៈពេល 4 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ° C បង្ហាញគំរូដូចគ្នានឹងការគ្រប់គ្រងអវិជ្ជមានដោយ gel electrophoresis ។
- E. coli gDNA៖វាស់ជាមួយអ៊ីកូលីឧបករណ៍រាវរក HCD ជាក់លាក់ 15 គ្រឿងនៃ RTL2.0 មានតិចជាង 1E. coliហ្សែន។
ការកំណត់ប្រតិកម្ម
ពិធីការសំយោគ cDNA
| សមាសធាតុ | កម្រិតសំឡេង |
| គំរូ RNA ក | ស្រេចចិត្ត |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) ឬ ល្បាយ primer ចៃដន្យ (60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM នីមួយៗ) | 1 μL |
| ថ្នាំទប់ស្កាត់ RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μL |
| ទឹកគ្មានជាតិនុយក្លេអ៊ែរ | រហូតដល់ 20 μL |
កំណត់ចំណាំ៖
1) កំរិតដែលបានណែនាំនៃ RNA សរុបគឺ 1ng ~ 1μg
2) កំរិតដែលបានណែនាំនៃ mRNA គឺ 50ng ~ 100ng
ទែរម៉ូ-ការជិះកង់ លក្ខខណ្ឌសម្រាប់ទម្លាប់ ប្រតិកម្ម៖
| សីតុណ្ហភាព (°C) | ពេលវេលា |
| ២៥ អង្សាសេa | 5 នាទី |
| 55 អង្សាសេ | 10 នាទីb |
| 80 អង្សាសេ | 10 នាទី |
កំណត់ចំណាំ៖
1) ប្រសិនបើការលាយ Primer ចៃដន្យត្រូវបានប្រើ ជំហាន incubation នៅ 25 ° C ។
2) ប្រសិនបើល្បាយ primer គោលដៅត្រូវបានប្រើ ជំហាន incubation នៅ 55 ° C សម្រាប់ 10 ~ 30 នាទី។
ពិធីការ RT-LAMP
| សមាសធាតុ | កម្រិតសំឡេង | ការផ្តោតអារម្មណ៍ចុងក្រោយ |
| គំរូ RNA | ស្រេចចិត្ត | ≥ 10 ច្បាប់ចម្លង |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 μL | 1.4 ម.ម |
| FIP/BIP Primers (25 ×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primers (25 ×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25 ×) | 1 μL | 0.4 μM |
| ថ្នាំទប់ស្កាត់ RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U / ប្រតិកម្ម |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U / ប្រតិកម្ម |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/ប្រតិកម្ម |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (សរុប 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (ឬ 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| ទឹកគ្មានជាតិនុយក្លេអ៊ែរ | រហូតដល់ 25 μL | - |
កំណត់ចំណាំ៖
1) លាយដោយ vortexing និង centrifuge ដោយសង្ខេបដើម្បីប្រមូល។incubation សីតុណ្ហភាពថេរនៅ 65 ° C រយៈពេល 1 ម៉ោង។
2) សតិបណ្ដោះអាសន្នទាំងពីរអាចដំណើរការគ្នាបាន និងមានសមាសភាពដូចគ្នា។
កំណត់ចំណាំ
1. ផលិតផលនេះនឹងបង្កើតជារឹងពណ៌សនៅពេលរក្សាទុកនៅ -20 ° C ។យកវាចេញពី -20°C ហើយដាក់លើទឹកកកប្រហែល 10 នាទី។បនា្ទាប់ពីរលាយវាអាចប្រើបានដោយអ្រងួននិងលាយ។
2. ផលិតផល cDNA អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -20 ° C ឬ -80 ° C ឬប្រើភ្លាមៗសម្រាប់ប្រតិកម្ម PCR ។
3. ដើម្បីទប់ស្កាត់ការចម្លងរោគ RNase សូមរក្សាកន្លែងពិសោធន៍ឱ្យស្អាត ហើយពាក់មដ និងម៉ាសស្អាតអំឡុងពេលប្រតិបត្តិការ។
