រសើបសីតុណ្ហភាព UNG
Temperature Sensitive UNG (TS-UNG) គឺជាការទទួលបានដោយកន្សោមផ្សំក្នុង E. coli ។អង់ស៊ីមនេះជំរុញការបញ្ចេញ uracil ដោយឥតគិតថ្លៃពី DNA ដែលមានខ្សែតែមួយ និងពីរខ្សែ ហើយអសកម្មប្រឆាំងនឹង RNA ។បើប្រៀបធៀបជាមួយអង់ស៊ីម UNG ធម្មតានៃប្រភពដើមហ្សែន E. coli អង់ស៊ីម TS-UNG មានសកម្មភាពខ្ពស់ជាងនៅសីតុណ្ហភាពទាប (20 ℃ ~ 37 ℃) និងងាយនឹងសីតុណ្ហភាព និងងាយអសកម្ម (50 ℃) ជៀសវាងការរិចរិលនៃអំព្លីដែលមានផ្ទុក dUTP ផលិតផលនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ដោយសកម្មភាពសំណល់ដែលអាចនៅតែមានបន្ទាប់ពីការអសកម្មនៃអង់ស៊ីម UNG ធម្មតា។ដូច្នេះ អង់ស៊ីម TS-UNG មិនត្រឹមតែស័ក្តិសមសម្រាប់ប្រតិកម្មការពារការចម្លងរោគ PCR ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែវាក៏ត្រូវគ្នាយ៉ាងល្អជាមួយនឹងកម្មវិធីពង្រីក RT-PCR និងអាចប្រើក្នុងប្រតិកម្មការពារការចម្លងរោគ RT-PCR ផងដែរ។
កម្មវិធីដែលបានណែនាំ
ការពង្រីកការការពារការចម្លងរោគ
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
-20°C សម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែង គួរលាយបញ្ចូលគ្នាឱ្យបានល្អមុនពេលប្រើប្រាស់ ជៀសវាងការកកញឹកញាប់។
សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្ទុក
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, ស្ថេរភាព, 50% Glycerol ។
និយមន័យឯកតា
បរិមាណអង់ស៊ីមដែលត្រូវការដើម្បីបង្ខូច 1µg នៃ DNA ខ្សែតែមួយដែលមានមូលដ្ឋាន dU ក្នុងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C គឺ 1 ឯកតានៃសកម្មភាព (U)។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
1.SDS-PAGE ភាពបរិសុទ្ធ electrophoretic ធំជាង 98%
2.សកម្មភាពរុះរើ, ការគ្រប់គ្រងជាបាច់, ស្ថេរភាព
3.មិនមានសកម្មភាពនុយក្លេអ៊ែរ exogenous គ្មានការចម្លងរោគ endonuclease ឬ exonuclease ។
សេចក្តីណែនាំ
| សមាសធាតុ | បរិមាណ (μL) | ការផ្តោតអារម្មណ៍ចុងក្រោយ |
| 10 × PCR Buffer (dNTP ឥតគិតថ្លៃ Mg²+ឥតគិតថ្លៃ) | 5 | 1 × |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ជំនួស dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 ម។ |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 1 U/μLTS-UNG | 0.5 (0.1-0.5) | 0.5 U (0.1-0.5U) |
| 25 × Primer Mixក | 2 | 1 × |
| គំរូ | - | 1μg/ប្រតិកម្ម |
| ddH₂O | ទៅ 50 | - |
ចំណាំ៖ ក៖ ប្រសិនបើប្រើសម្រាប់ qPCR/qRT-PCR ការស៊ើបអង្កេត fluorescent គួរតែត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។ជាធម្មតាកំហាប់បឋមចុងក្រោយនៃ 0.2 μM អាចផ្តល់លទ្ធផលល្អ;នៅពេលដែលដំណើរការប្រតិកម្មខ្សោយ កំហាប់បឋមអាចត្រូវបានកែតម្រូវក្នុងចន្លោះ 0.2-1 μM។ជាធម្មតា កំហាប់ស៊ើបអង្កេតត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងក្នុងចន្លោះ 0.1-0.3 μM។ការពិសោធន៍ជម្រាលការផ្តោតអារម្មណ៍អាចត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីស្វែងរកការរួមបញ្ចូលគ្នាដ៏ល្អបំផុតនៃ primer និង probe ។
កំណត់ចំណាំ
1.សីតុណ្ហភាពប្រតិកម្មល្អបំផុតនៃអង់ស៊ីម TS-UNG មានកម្រិតទាប ហើយវាអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរក្នុងចន្លោះ 20 ℃ ~ 37 ℃ កម្រិតនៃអង់ស៊ីម និងពេលវេលាប្រតិកម្មអាចត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរក្នុងចន្លោះ 0.1 ~ 0.5 U, 5 ~ ។ 10 នាទី;ហើយអង់ស៊ីមអាចត្រូវបានអសកម្មនៅក្នុងដំណើរការនៃការចម្លងបញ្ច្រាស។
2.វាសមស្របសម្រាប់ PCR និង RT-PCR ដើម្បីការពារការចម្លងរោគ។
3.ជៀសវាងការកកញឹកញាប់ ហើយកុំប៉ះពាល់នឹងការប្រែប្រួលសីតុណ្ហភាពធំ។
4.ហ្សែនផ្សេងៗគ្នាដែលត្រូវបានពង្រីកមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការប្រើប្រាស់ខុសៗគ្នានៃ dUTP និងភាពរសើបចំពោះអង់ស៊ីម UNG ដូច្នេះប្រសិនបើការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ UNG នាំឱ្យថយចុះនូវភាពរសើបនៃការរកឃើញ ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មគួរតែត្រូវបានកែតម្រូវ និងធ្វើឱ្យប្រសើរ ប្រសិនបើអ្នកត្រូវការជំនួយបច្ចេកទេស សូមទាក់ទង ក្រុមហ៊ុនរបស់យើង។
