ឧបករណ៍វាយអក្សរកណ្តុរ
លេខឆ្មា៖ HCR2021A
ផលិតផលនេះគឺជាឧបករណ៍ដែលបានរចនាឡើងសម្រាប់ការកំណត់អត្តសញ្ញាណយ៉ាងឆាប់រហ័សនៃប្រភេទសត្វកណ្តុរ រួមទាំងការទាញយកប្រេងឆៅ DNA និងប្រព័ន្ធពង្រីក PCR ។ផលិតផលនេះអាចត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR ដោយផ្ទាល់ពីកន្ទុយកណ្ដុរ ត្រចៀក ម្រាមជើង និងជាលិកាផ្សេងទៀតបន្ទាប់ពីការបំបែកសាមញ្ញដោយ Lysis Buffer និង Proteinase k ។គ្មានការរំលាយអាហារពេញមួយយប់ ការស្រង់ចេញ phenol-chloroform ឬការបន្សុតជួរឈរ ដែលមានលក្ខណៈសាមញ្ញ និងកាត់បន្ថយពេលវេលានៃការពិសោធន៍។ផលិតផលនេះគឺសមរម្យសម្រាប់ការពង្រីកបំណែកគោលដៅរហូតដល់ 2kb និងប្រតិកម្ម PCR multiplex ជាមួយនឹង primers រហូតដល់ 3 គូ។2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix មានផ្ទុកនូវ DNA polymerase ដែលផលិតតាមហ្សែន Mg2+, dNTPs និងប្រព័ន្ធសតិបណ្ដោះអាសន្នដែលត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងដើម្បីផ្តល់នូវប្រសិទ្ធភាពនៃការកើនឡើងខ្ពស់ និងការអត់ធ្មត់របស់ inhibitor ដូច្នេះប្រតិកម្ម PCR អាចត្រូវបានអនុវត្តដោយបន្ថែមគំរូ និង primers និង rehydrating ផលិតផលទៅ 1× ។ផលិតផល PCR ពង្រីកជាមួយផលិតផលនេះមានមូលដ្ឋាន “A” លេចធ្លោនៅចុងបញ្ចប់ 3′ ហើយអាចត្រូវបានប្រើដោយផ្ទាល់សម្រាប់ការក្លូន TA បន្ទាប់ពីការបន្សុត។
សមាសធាតុ
| សមាសភាគ | ទំហំ |
| 2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix | 5 × 1.0 មីលីលីត្រ |
| Lysis Buffer | 2 × 20 មីលីលីត្រ |
| ប្រូតេអ៊ីន K | 800 μL |
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
ផលិតផលគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -25 ~ -15 ℃សម្រាប់រយៈពេល 2 ឆ្នាំ។បន្ទាប់ពីរលាយហើយ Lysis Buffer អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2 ~ 8 ℃ សម្រាប់ការប្រើប្រាស់ច្រើនរយៈពេលខ្លី ហើយលាយឱ្យបានល្អពេលប្រើ។
ការដាក់ពាក្យ
ផលិតផលនេះគឺសមរម្យសម្រាប់ការវិភាគការគោះកណ្ដុរ ការរកឃើញ transgenic ការធ្វើ genotyping និងដូច្នេះនៅលើ។
លក្ខណៈពិសេស
១.ប្រតិបត្តិការសាមញ្ញ៖ មិនចាំបាច់ទាញយក DNA ហ្សែនទេ។
២.កម្មវិធីធំទូលាយ៖ សមស្របសម្រាប់ការពង្រីកដោយផ្ទាល់នៃជាលិកាកណ្តុរផ្សេងៗ។
សេចក្តីណែនាំ
១.ការចេញផ្សាយ DNA ហ្សែន
1) ការរៀបចំ lysate
Tissue lysate ត្រូវបានរៀបចំដោយយោងទៅតាមចំនួនសំណាកកណ្តុរដែលត្រូវលីសេត (ជាលិកា lysate គួរតែត្រូវបានរៀបចំនៅនឹងកន្លែងដោយយោងតាមកម្រិតថ្នាំ និងលាយបញ្ចូលគ្នាយ៉ាងហ្មត់ចត់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់) ហើយសមាមាត្រនៃសារធាតុ reagents ដែលត្រូវការសម្រាប់សំណាកតែមួយមានដូចខាងក្រោម៖
| សមាសធាតុ | បរិមាណ (μL) |
| ប្រូតេអ៊ីន K | 4 |
| Lysis Buffer | ២០០ |
2) ការរៀបចំគំរូនិងលីស
ការប្រើប្រាស់ជាលិកាដែលបានណែនាំ
| ប្រភេទនៃជាលិកា | កម្រិតសំឡេងដែលបានណែនាំ |
| កន្ទុយកណ្ដុរ | 1-3 ម។ |
| ត្រចៀកកណ្ដុរ | 2-5 ម។ |
| ម្រាមជើងកណ្ដុរ | 1-2 បំណែក |
យកសំណាកជាលិកាកណ្ដុរក្នុងបរិមាណសមស្របនៅក្នុងបំពង់ centrifuge ស្អាត បន្ថែម 200μL នៃជាលិកាស្រស់ lysate ទៅក្នុងបំពង់ centrifuge នីមួយៗ vortex និងអ្រងួន បន្ទាប់មក incubate នៅសីតុណ្ហភាព 55 ℃ សម្រាប់ 30 នាទី ហើយបន្ទាប់មកកំដៅនៅ 98 ℃ រយៈពេល 3 នាទី។
3) ការផ្តោតអារម្មណ៍
អ្រងួន lysate ឱ្យបានល្អហើយ centrifuge នៅ 12,000 rpm សម្រាប់ 5 នាទី។supernatant អាចត្រូវបានប្រើជាគំរូសម្រាប់ការពង្រីក PCR ។ប្រសិនបើគំរូត្រូវការសម្រាប់ការផ្ទុក សូមផ្ទេរ supernatant ទៅបំពង់ centrifuge មាប់មគមួយផ្សេងទៀត ហើយរក្សាទុកនៅ -20 ℃ រយៈពេល 2 សប្តាហ៍។
២.ការពង្រីក PCR
យក 2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix ចេញពី -20 ℃ ហើយរលាយនៅលើទឹកកក លាយចិត្តសប្បុរសដោយអាស្រ័យចុះ ហើយរៀបចំប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម PCR តាមតារាងខាងក្រោម (ដំណើរការលើទឹកកក)៖
| សមាសធាតុ | 25μLប្រព័ន្ធ | 50μLប្រព័ន្ធ | ការផ្តោតអារម្មណ៍ចុងក្រោយ |
| 2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix | 12.5 μL | 25 μL | 1 × |
| ថ្នាំ primer 1 (10μM) | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4 μM |
| ថ្នាំ primer 2 (10μM) | 1.0 μL | 2.0 μL | 0.4 μM |
| ផលិតផលបំបែកa | តាមតម្រូវការ | តាមតម្រូវការ |
|
| ddH2O | រហូតដល់ 25 μL | រហូតដល់ 50 μL |
|
ចំណាំ៖
ក) បរិមាណដែលបានបន្ថែមមិនគួរលើសពី 1/10 នៃប្រព័ន្ធទេ ហើយប្រសិនបើបន្ថែមច្រើនពេក ការពង្រីក PCR អាចត្រូវបានរារាំង។
លក្ខខណ្ឌ PCR ដែលបានណែនាំ
| ជំហានវដ្ត | សីតុណ្ហភាព | ពេលវេលា | វដ្ត |
| ការប្រែពណ៌ដើម | ៩៤ អង្សាសេ | 5 នាទី | 1 |
| ការប្រែពណ៌ | ៩៤ អង្សាសេ | 30 វិ | ៣៥-៤០ |
| ការស្រើបស្រាលa | Tm + 3 ~ 5 ℃ | 30 វិ | |
| ផ្នែកបន្ថែម | ៧២ អង្សាសេ | 30 វិនាទី/គីឡូបៃ | |
| ផ្នែកបន្ថែមចុងក្រោយ | ៧២ អង្សាសេ | 5 នាទី | 1 |
| - | 4 ℃ | កាន់ | - |
ចំណាំ៖
ក) សីតុណ្ហភាពបិទភ្ជាប់៖ ដោយយោងទៅលើតម្លៃ Tm នៃ primer វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យកំណត់សីតុណ្ហភាព annealing ទៅតម្លៃ Tm តូចជាងនៃ primer +3 ~ 5 ℃។
បញ្ហាទូទៅ និងដំណោះស្រាយ
១.គ្មានក្បាលដីគោលដៅ
1) ផលិតផលលីសច្រើនពេក។ជ្រើសរើសចំនួនគំរូដែលសមស្របបំផុត ជាធម្មតាមិនលើសពី 1/10 នៃប្រព័ន្ធ។
2) ទំហំគំរូធំពេក។ពនឺ lysate 10 ដង ហើយបន្ទាប់មកពង្រីក ឬកាត់បន្ថយទំហំសំណាក ហើយធ្វើ lysis ឡើងវិញ។
3) គំរូជាលិកាមិនស្រស់។វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យប្រើគំរូជាលិកាស្រស់;
4) គុណភាពបឋមទាប។ប្រើ DNA ហ្សែនសម្រាប់ការពង្រីកដើម្បីផ្ទៀងផ្ទាត់គុណភាព primer និងបង្កើនប្រសិទ្ធភាពការរចនា primer ។
២.ការពង្រីកមិនជាក់លាក់
1) សីតុណ្ហភាព annealing គឺទាបពេកហើយចំនួនវដ្តគឺខ្ពស់ពេក។បង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing និងកាត់បន្ថយចំនួននៃវដ្ត;
2) កំហាប់គំរូខ្ពស់ពេក។កាត់បន្ថយបរិមាណពុម្ព ឬពនលាយទម្រង់ 10 ដងបន្ទាប់ពីការពង្រីក;
3) ភាពជាក់លាក់នៃ primer មិនល្អ។បង្កើនប្រសិទ្ធភាពការរចនាបឋម។
កំណត់ចំណាំ
១.ដើម្បីជៀសវាងការចម្លងរោគរវាងគំរូ ឧបករណ៍សំណាកជាច្រើនគួរតែត្រូវបានរៀបចំ ហើយផ្ទៃរបស់ឧបករណ៍អាចត្រូវបានសម្អាតជាមួយនឹងដំណោះស្រាយសូដ្យូមអ៊ីប៉ូក្លរីត 2% ឬទឹកអាស៊ីត nucleic បន្ទាប់ពីសំណាកនីមួយៗ ប្រសិនបើការប្រើប្រាស់ម្តងហើយម្តងទៀតត្រូវបានទាមទារ។
២.វាត្រូវបានផ្ដល់អនុសាសន៍ឱ្យប្រើជាលិកាកណ្ដុរស្រស់ ហើយបរិមាណគំរូមិនគួរធំពេកដើម្បីជៀសវាងការប៉ះពាល់ដល់លទ្ធផលពង្រីក។
៣.Lysis Buffer គួរជៀសវាងការកកញឹកញាប់ ហើយអាចរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2~8 ℃ សម្រាប់ការប្រើប្រាស់ច្រើនរយៈពេលខ្លី។ប្រសិនបើទុកនៅសីតុណ្ហភាពទាប ទឹកភ្លៀងអាចកើតឡើង ហើយត្រូវរំលាយទាំងស្រុងមុនពេលប្រើប្រាស់។
៤.PCR Mix គួរតែជៀសវាងការកកញឹកញាប់ ហើយអាចរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 4 ℃ សម្រាប់ការប្រើប្រាស់ម្តងហើយម្តងទៀតក្នុងរយៈពេលខ្លី។
៥.ផលិតផលនេះគឺសម្រាប់តែការស្រាវជ្រាវពិសោធន៍វិទ្យាសាស្ត្រប៉ុណ្ណោះ ហើយមិនគួរប្រើក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆយ ឬព្យាបាលនោះទេ។
