ប្រូតេអ៊ីន K mNGS (រាវ)
Proteinase K គឺជាប្រូតេអ៊ីន serine ដែលមានស្ថេរភាពជាមួយនឹងភាពជាក់លាក់នៃស្រទាប់ខាងក្រោមធំទូលាយ។វាបំផ្លាញប្រូតេអ៊ីនជាច្រើននៅក្នុងរដ្ឋកំណើតសូម្បីតែនៅក្នុងវត្តមានរបស់ detergents ។ភ័ស្តុតាងពីការសិក្សាអំពីរចនាសម្ព័ន្ធគ្រីស្តាល់ និងម៉ូលេគុលបង្ហាញថា អង់ស៊ីមជាកម្មសិទ្ធិរបស់ក្រុមគ្រួសារ subtilisin ដែលមានទីតាំងសកម្ម catalytic triad (Asp39- របស់គាត់។69-ស៊ែ២២៤)កន្លែងលេចធ្លោនៃការបំបែកគឺចំណង peptide ដែលនៅជាប់នឹងក្រុម carboxyl នៃអាស៊ីតអាមីណូ aliphatic និង aromatic ជាមួយនឹងក្រុមអាល់ហ្វាអាមីណូដែលត្រូវបានទប់ស្កាត់។វាត្រូវបានគេប្រើជាទូទៅសម្រាប់ភាពជាក់លាក់ទូលំទូលាយរបស់វា។ប្រូតេអ៊ីន K នេះត្រូវបានរចនាឡើងជាពិសេសសម្រាប់ mNGS ។បើប្រៀបធៀបជាមួយប្រូតេអ៊ីន K ផ្សេងទៀត វាមានផ្ទុកអាស៊ីត nucleic តិចជាងមុនជាមួយនឹងដំណើរការអង់ស៊ីមដូចគ្នា ដែលអាចធានាបាននូវកម្មវិធី mNGS ខាងក្រោមបានប្រសើរជាង។
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
2-8 អង្សាសេរយៈពេល 2 ឆ្នាំ។
ការបញ្ជាក់
| រូបរាង | រាវគ្មានពណ៌ទៅពណ៌ត្នោតខ្ចី |
| សកម្មភាព | ≥800 U/ml |
| ការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន | ≥20mg/ml |
| នីកាស | រកមិនឃើញទេ។ |
| ឌីណាស | រកមិនឃើញទេ។ |
| RNase | រកមិនឃើញទេ។ |
ទ្រព្យសម្បត្តិ
| លេខ EC | ៣.៤.២១.៦៤(ផ្សំពីអាល់ប៊ុម Tritirachium) |
| ចំណុចអ៊ីសូអេឡិចត្រិច | ៧.៨១ |
| pH ល្អបំផុត | ៧.០- ១២.០ រូប ១ |
| សីតុណ្ហភាពល្អបំផុត | 65 ℃ រូប 2 |
| ស្ថេរភាព pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 ម៉ោង) រូបភាពទី 3 |
| ស្ថេរភាពកំដៅ | ក្រោម 50 ℃ (pH 8.0, 30 នាទី) រូបភាពទី 4 |
| ស្ថេរភាពការផ្ទុក | សកម្មភាពជាង 90% សម្រាប់រយៈពេល 12 ខែនៅសីតុណ្ហភាព 25 ℃ |
| ភ្នាក់ងារធ្វើឱ្យសកម្ម | SDS, អ៊ុយ |
| អ្នករារាំង | Diisopropyl fluorophosphate;ហ្វ្លុយអូរី phenylmethylsulfonyl |
កម្មវិធី
1. ឧបករណ៍ធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យហ្សែន
2. ឧបករណ៍ទាញយក RNA និង DNA
3. ការទាញយកសមាសធាតុដែលមិនមែនជាប្រូតេអ៊ីនចេញពីជាលិកា ការរិចរិលនៃសារធាតុមិនបរិសុទ្ធនៃប្រូតេអ៊ីន ដូចជា DNAវ៉ាក់សាំងនិងការរៀបចំ heparin
4. ការរៀបចំក្រូម៉ូសូម DNA ដោយ electrophoresis ជីពចរ
5. blot ខាងលិច
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents in vitro diagnosis
ការប្រុងប្រយ័ត្នជាមុន
ពាក់ស្រោមដៃ និងវ៉ែនតាការពារនៅពេលប្រើ ឬថ្លឹង ហើយរក្សាខ្យល់ឱ្យបានល្អបន្ទាប់ពីប្រើរួច។ផលិតផលនេះអាចបណ្តាលឱ្យមានប្រតិកម្មអាលែហ្សីលើស្បែក និងរលាកភ្នែកធ្ងន់ធ្ងរ។ប្រសិនបើស្រូបចូល វាអាចបណ្តាលឱ្យមានអាឡែស៊ី ឬរោគសញ្ញានៃជំងឺហឺត ឬហឺត។អាចបណ្តាលឱ្យរលាកផ្លូវដង្ហើម។
និយមន័យឯកតា
ឯកតាមួយ (U) ត្រូវបានកំណត់ថាជាបរិមាណអង់ស៊ីមដែលត្រូវការសម្រាប់ hydrolyze casein ដើម្បីបង្កើត 1 μmoltyrosine ក្នុងមួយនាទីក្រោមលក្ខខណ្ឌដូចខាងក្រោម។
ការរៀបចំសារធាតុ
Reagent I: ទឹកដោះគោ 1g casein ត្រូវបានរំលាយក្នុង 50ml នៃសូលុយស្យុង 0.1M sodium phosphate (pH 8.0) incubated in 65-70℃ water for 15mins, stirred and dissolved, cooled by water, adjust by sodium hydroxide to pH 8.0, និងបរិមាណថេរ 100ml ។
Reagent II: 0.1M អាស៊ីត trichloroacetic, 0.2M sodium acetate, 0.3M acetic acid។
Reagent III: 0.4M Na2CO3ដំណោះស្រាយ។
Reagent IV: Forint reagent ពនឺជាមួយទឹកសុទ្ធ 5 ដង។
Reagent V: អង់ស៊ីម diluent: 0.1M សូលុយស្យុង phosphate sodium (pH 8.0)។
Reagent VI: ដំណោះស្រាយ tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine រំលាយជាមួយ 0.2M HCl ។
នីតិវិធី
1. 0.5ml នៃ reagent I ត្រូវបានកំដៅមុនដល់ 37 ℃ បន្ថែម 0.5ml នៃដំណោះស្រាយ enzyme, លាយអោយសព្វ ហើយ incubate នៅ៣៧ អង្សាសេរយៈពេល ១០ នាទី។
2. បន្ថែម 1ml នៃ reagent II ដើម្បីបញ្ឈប់ប្រតិកម្ម, លាយឱ្យល្អ, និងបន្ត incubation សម្រាប់ 30 នាទី។
3. ដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម centrifugate ។
4. យក 0.5ml supernatant បន្ថែម 2.5ml reagent III, 0.5ml reagent IV លាយអោយសព្វ ហើយ incubate នៅសីតុណ្ហភាព 37℃សម្រាប់ 30 នាទី។
5. OD៦៦០ត្រូវបានកំណត់ជា OD1;ក្រុមត្រួតពិនិត្យទទេ៖ 0.5ml reagent V ត្រូវបានប្រើដើម្បីជំនួសអង់ស៊ីមដំណោះស្រាយដើម្បីកំណត់ OD៦៦០ជា OD2, ΔOD=OD1-អូឌី2.
6. ខ្សែកោងស្តង់ដារ L-tyrosine៖ ដំណោះស្រាយ L-tyrosine កំហាប់ខុសគ្នា 0.5mL, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV ក្នុងបំពង់ centrifuge 5mL, ញាស់ក្នុង 37 ℃ រយៈពេល 30 នាទី រកមើល OD៦៦០សម្រាប់កំហាប់ L-tyrosine ផ្សេងគ្នា បន្ទាប់មកទទួលបានខ្សែកោងស្តង់ដារ Y=kX+b ដែល Y ជាកំហាប់ L-tyrosine X គឺ OD៦០០.
ការគណនា
2: បរិមាណសរុបនៃដំណោះស្រាយប្រតិកម្ម (ml)
0.5: បរិមាណនៃដំណោះស្រាយអង់ស៊ីម (mL)
0.5: បរិមាណរាវប្រតិកម្មដែលប្រើក្នុងការកំណត់ chromogenic (mL)
10: ពេលវេលាប្រតិកម្ម (នាទី)
Df៖ ការរំលាយច្រើន
Cកំហាប់អង់ស៊ីម (mg/mL)
ឯកសារយោង
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett ។(១៩៧២);២៣:៧៧ .
2. Wieger U & Hilz H. Biochem ។ជីវវិទ្យា។Res.កុម្មុយនិស្ត។(១៩៧១);៤៤:៥១៣ .
3. Hilz, H.et al ។អឺរ៉ូ។J. Biochem ។(១៩៧៥);៥៦:១០៣–១០៨។
4. Sambrook Jet អាល់។ , ការក្លូនម៉ូលេគុល៖ សៀវភៅដៃមន្ទីរពិសោធន៍ បោះពុម្ពលើកទី២ កំពង់ផែត្រជាក់ស្ព្រីងសារព័ត៌មានមន្ទីរពិសោធន៍ Cold Spring Harbor (១៩៨៩)។
តួលេខ
រូប.1 ល្អបំផុត pH
ដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្ន 100mM: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH កំហាប់អង់ស៊ីម: 1mg/mL
រូបភាពទី 2 សីតុណ្ហភាពល្អបំផុត
ប្រតិកម្មក្នុង 20 mM K-phosphate buffer pH 8.0 ។កំហាប់អង់ស៊ីម: 1 មីលីក្រាម / មីលីលីត្រ
រូបភាពទី 3 pH ស្ថេរភាព
25 ℃, 16 ម៉ោង - ការព្យាបាលជាមួយនឹងដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្ន 50 mM: pH 4.5- 5.5, អាសេតាត;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl ។pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH ។កំហាប់អង់ស៊ីម: 1 មីលីក្រាម / មីលីលីត្រ
រូបភាពទី 4 កំដៅ ស្ថេរភាព
ការព្យាបាលរយៈពេល 30 នាទីជាមួយនឹង 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0 ។កំហាប់អង់ស៊ីម: 1 មីលីក្រាម / មីលីលីត្រ
Fig.5 ការផ្ទុក ស្ថិរភាពty at ២៥ អង្សាសេ
