Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG ឬ UDG) គឺជាក្លូនដែលផ្សំឡើងវិញនៃ E.coli ដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុល 25 kDa ។វាជំរុញការបញ្ចេញ uracil ដោយឥតគិតថ្លៃពី uracil ដែលមានខ្សែតែមួយ និងពីរខ្សែ DNA ហើយអសកម្មប្រឆាំងនឹង RNA ហើយអាចត្រូវបានប្រើដើម្បីការពារការចម្លងរោគនៃផលិតផល PCR amplification ។គោលការណ៍នៃសកម្មភាពគឺផ្អែកលើការពិតដែលថាប្រសិនបើ dUTP ត្រូវបានជំនួសសម្រាប់ dTTP នៅក្នុងប្រតិកម្ម PCR និងផលិតផលពង្រីក PCR ដែលមានមូលដ្ឋាន dU ត្រូវបានបង្កើតឡើង អង់ស៊ីមអាចជ្រើសរើសបំបែកចំណង glycosidic នៃមូលដ្ឋាន U នៅក្នុងខ្សែតែមួយ និងខ្សែទ្វេ។ DNA និងធ្វើឱ្យខូចផលិតផលពង្រីក PCR ។
កម្មវិធីដែលបានណែនាំ
ការពង្រីកការការពារការចម្លងរោគ
លក្ខខណ្ឌផ្ទុក
-20°C សម្រាប់ការរក្សាទុករយៈពេលវែង គួរលាយបញ្ចូលគ្នាឱ្យបានល្អមុនពេលប្រើប្រាស់ ជៀសវាងការកកញឹកញាប់។
សតិបណ្ដោះអាសន្នផ្ទុក
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, ស្ថេរភាព, 50% Glycerol ។
និយមន័យឯកតា
បរិមាណអង់ស៊ីមដែលត្រូវការដើម្បីបង្ខូច 1µg នៃ DNA ខ្សែតែមួយដែលមានមូលដ្ឋាន dU ក្នុងរយៈពេល 1 ម៉ោងនៅសីតុណ្ហភាព 37°C គឺ 1 ឯកតា។
ការត្រួតពិនិត្យគុណភាព
1.SDS-PAGE ភាពបរិសុទ្ធ electrophoretic ធំជាង 98%
2.ភាពរសើបនៃការពង្រីក, ការត្រួតពិនិត្យជាបាច់, ស្ថេរភាព
3.បន្ទាប់ពី 1U នៃ UNG ត្រូវបានព្យាបាលនៅ 50 ℃ សម្រាប់រយៈពេល 2 នាទី គំរូដែលមាន U ក្រោម 103 ច្បាប់ចម្លងគួរតែត្រូវបានបង្ខូចទាំងស្រុង ហើយគ្មានផលិតផល amplification អាចផលិតបានទេ។
4.មិនមានសកម្មភាពនុយក្លេអ៊ែរខាងក្រៅទេ។
សេចក្តីណែនាំ
| សមាសធាតុ | បរិមាណ (μL) | ការផ្តោតអារម្មណ៍ចុងក្រោយ |
| 10 × PCR Buffer (dNTP ឥតគិតថ្លៃ Mg²+ឥតគិតថ្លៃ) | 5 | 1 × |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ជំនួស dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 ម។ |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Primer Mixក | 2 | 1 × |
| គំរូ | - | 1μg/ប្រតិកម្ម |
| ddH₂O | ទៅ 50 | - |
ចំណាំ៖ a: ប្រសិនបើប្រើសម្រាប់ qPCR/qRT-PCR ការស៊ើបអង្កេត fluorescent គួរតែត្រូវបានបញ្ចូលទៅក្នុងប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម។ជាធម្មតាកំហាប់បឋមចុងក្រោយនៃ 0.2 μM អាចផ្តល់លទ្ធផលល្អ;នៅពេលដែលដំណើរការប្រតិកម្មខ្សោយ កំហាប់បឋមអាចត្រូវបានកែតម្រូវក្នុងចន្លោះ 0.2-1 μM។ជាធម្មតា កំហាប់ស៊ើបអង្កេតត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរឡើងក្នុងចន្លោះ 0.1-0.3 μM។ការពិសោធន៍ជម្រាលការផ្តោតអារម្មណ៍អាចត្រូវបានអនុវត្តដើម្បីស្វែងរកការរួមបញ្ចូលគ្នាដ៏ល្អបំផុតនៃ primer និង probe ។
កំណត់ចំណាំ
1.អង់ស៊ីម UNG អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីយកផលិតផល amplification dUTP កខ្វក់ចេញពីប្រព័ន្ធប្រតិកម្ម មុនពេលប្រតិកម្ម PCR amplification បន្ទាប់មកដើម្បីជៀសវាងលទ្ធផលវិជ្ជមានមិនពិតដោយសារតែការចម្លងរោគផលិតផល។
2.សីតុណ្ហភាពល្អបំផុតសម្រាប់អង់ស៊ីម UNG ដែលត្រូវប្រើក្នុងប្រតិកម្មប្រឆាំងការចម្លងរោគ PCR ជាទូទៅគឺ 50 ℃ សម្រាប់ 2 នាទី;លក្ខខណ្ឌអសកម្មគឺ 95 ℃សម្រាប់ 5 នាទី។
3.ជៀសវាងការកកញឹកញាប់ ហើយកុំប៉ះពាល់នឹងការប្រែប្រួលសីតុណ្ហភាពធំ។
4.ហ្សែនផ្សេងៗគ្នាដែលត្រូវបានពង្រីកមានប្រសិទ្ធភាពក្នុងការប្រើប្រាស់ខុសៗគ្នានៃ dUTP និងភាពរសើបចំពោះអង់ស៊ីម UNG ដូច្នេះប្រសិនបើការប្រើប្រាស់ប្រព័ន្ធ UNG នាំឱ្យថយចុះនូវភាពរសើបនៃការរកឃើញ ប្រព័ន្ធប្រតិកម្មគួរតែត្រូវបានកែតម្រូវ និងធ្វើឱ្យប្រសើរ ប្រសិនបើអ្នកត្រូវការជំនួយបច្ចេកទេស សូមទាក់ទង ក្រុមហ៊ុនរបស់យើង។
